大肠杆菌菌株ATCC 25922碱性磷酸酶的原核表达、纯化及其活性研究

高明春，李雪萌，张润祥，王君伟

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AP广泛存在于多种细菌、真菌及动物中。不同来源AP的分子质量大小、编码序列差异很大，而且各物种AP的性质、结构、功能与催化机理也不尽相同[2-3]。在这其中，大肠杆菌AP（Escherichia coli alkaline phosphatase，EAP）的有关研究最为透彻。EAP由ρhoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，分子质量为47 ku，活性中心包括3个金属离子[4]。因EAP催化机理明晰，底物范围广泛，目前被作为信号酶而广泛应用于医学、免疫学和分析生物技术领域[5-6]。大肠杆菌ATCC 25922无致病性和耐药基因，在生物研究领域通常将其作为对照用标准大肠杆菌模式菌株[7-9]，但ATCC 25922 EAP的研究未见报道，其分子序列与酶活性等均属未知，本研究克隆并表达了来自大肠杆菌菌株ATCC 25922的EAP成熟肽基因，并对其进行了纯化以及功能研究，以期为ATCC 25922 EAP的研究与应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体和试剂

大肠杆菌菌株E.coli ATCC 25922、克隆宿主菌TG1为本室（东北农业大学动物医学学院微生物与免疫教研室）保存；纯品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白（即EAP N端融合有抗鹅γ干扰素单链抗体的重组蛋白）本室制备并保存；表达宿主菌RosettaTM（DE3）pLysS、原核表达载体 pET-30a（+）购自Novagen公司；pMD18-T-simple、T4DNA连接酶、限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、碱性磷酸酶底物对硝基苯磷酸（pNPP）购自美国Amresco公司。

1.1.2 引物

参照E.coli K12的ρhoA基因序列（Accession NO.CP000948.1），使用Primer Premier5设计并合成用于扩增EAP成熟肽基因的引物，即EAP1 5'GCAGGATCCCGGACACCAGAAATG 3'与EAP2 5'GAGCCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGA 3'，分别带有Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 EAP的克隆

按照细菌基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）说明书操作，提取ATCC 25922基因组，并以此为模板，克隆EAP基因。PCR产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。纯化回收PCR产物，与pMD18-T-simple载体连接后转化入TG1，在Amp平板上挑选单菌落活化后提取质粒，酶切及PCR鉴定正确后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序服务。

重组表达载体pET-30a-EAP的构建及鉴定参照文献[7]进行，将连接在T载体上的EAP基因以Bam HⅠ、XhoⅠ消化下来并回收纯化，与相同酶切回收的pET-30a连接，转化TG1后涂布Kan抗性平板进行筛选，提取质粒进行酶切及PCR鉴定。

1.2.2 EAP基因表达与可溶性分析

将鉴定正确的pET-30a-EAP转化入Rosetta（DE3），按1%的比例接种阳性菌液至含有200 mL LB的培养瓶，然后置于30℃220 r·min-1摇床振荡培养，在菌液OD600约为0.4时加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG进行诱导，继续培养6 h。取1 mL诱导后的菌液离心后进行SDS-PAGE分析。另取10 mL菌液离心、超声波处理后上清液用于蛋白可溶性分析。剩余菌液离心后将湿菌储存于-70℃冰箱备用。

1.2.3 rEAP纯化流程

取前一步诱导后的湿菌重悬于20 mL的NPB缓 冲 液（Native purification buffer， 50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl），4℃5 000 r·min-1离心15 min后再重悬于12 mL NPB，反复冻融3次后在冰浴环境中超声破碎菌体，8 000 r·min-115 min离心后，上清组分用于可溶性rEAP蛋白纯化。将细菌裂解液上清7 mL过滤后加入柱式Ni-NTA纯化系统（Invitrogen，1 mL填料），采用说明书所载的正常条件下的pH梯度洗脱方式并稍作改进对可溶性rEAP进行纯化。菌体裂解液与Ni-NTA作用1 h后，以Buffer A～D（即将NPB pH分别调至8.0、7.2、6.6和5.3）进行洗涤，每次2 mL，每种溶液各洗涤 2 次；Buffer E～G（100 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1KCl，pH 分别为 4.2、3.7、3.3和3.0）进行洗脱，每次1 mL，每种溶液洗脱3次；最后用4 mL的0.01 mol·L-1NaOH洗柱2次，每次2 mL。对各级洗涤与洗脱液进行SDS-PAGE分析，并用Bradford法对蛋白进行定量。

1.2.4 rEAP酶促反应特性

1.2.4.1 浓度对rEAP催化速率的影响

取空白酶标板一块，室温下每孔添加pNPP显色底物溶液（50 mg·L-1pNPP，1 mmol·L-1MgCl2溶于0.1 mol·L-1二乙醇胺缓冲液（pH 9.8））50 μL，然后分别按以下体积添加纯化的rEAP：0、32、16、8、4、2、1、0.5 μL，去离子水将每孔补齐至 100 μL。室温反应20 min后，每孔添加 50 μL 3 mol·L-1NaOH终止反应，并用酶标仪测定此时的OD405nm。

1.2.4.2 热稳定性试验

将EAP置于100℃水浴10 min，恢复室温后静置30 min，再按1.2.4.1条件进行试验。

1.2.4.3 rEAP N端定向标记多肽的酶促反应

纯品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白，按物质的量浓度折算为与1.2.4.1中EAP相当的浓度，进行pNPP显色反应，评估N端融合多肽对ATCC 25922 EAP催化能力的影响。

1.2.4.4 温度对酶促反应动力的影响

将1.2.4.1的反应温度分别改为25、37、50、56和65℃，其他条件不变进行显色试验。1.2.5 DNA去磷酸化试验

从琼脂糖凝胶回收Bam HⅠ酶切后的pET-30a（+）载体，分别用或不用 rEAP（0.35 mg·mL-1）去磷酸化，并转化入100 μL TG1。计数平板上菌落数，以评估rEAP对DNA去磷酸化的效果。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌菌株ATCC 25922 EAP成熟肽基因的克隆与鉴定

EAP成熟肽基因克隆入pMD18-T-simple载体后，酶切验证结果如图1所示。pMD18-T-simple-EAP经XhoⅠ单酶切，片段长为4.1 kb。该载体经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切，得到1.4和2.7 kb两个片段。测序结果表明克隆的该基因为ATCC 25922株大肠杆菌EAP成熟肽基因。

2.2 表达载体pET-30a-EAP的酶切与PCR鉴定

表达载体pET-30a-EAP经XhoⅠ或Bam HⅠ单酶切后得6.8 kb的片段，XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切后，得到5.4和1.4 kb两个片段。PCR产物应出现1.4 kb左右片段。如图2所示，电泳结果与预期相符。

图1 酶切鉴定pMD18-T-EAPFig.1 Identification of pMD18-T-EAP with restriction enzyme

图2 pET-30a-EAP的酶切及PCR鉴定Fig.2 Identification pET-30a-EAP with restriction and PCR

2.3 EAP蛋白的可溶性分析

如图3所示，重组菌IPTG诱导后在预期位置可观测到明显的蛋白表达条带，而对照菌却没有。重组EAP的表达量在28%左右，并且绝大部分产物为可溶性表达。

图3 EAP蛋白表达的SDS-PAGE分析Fig.3 Detecting EAP expressed product with SDS-PAGE

2.4 rEAP蛋白纯化工艺研究

对可溶性rEAP进行pH梯度洗脱法的金属亲合层析纯化，结果如图4所示。pH低于4.2时，EAP开始与亲合基质解离，此时某些杂质蛋白也被洗脱，至pH 3.7之后的组份较为纯净，光密度扫描分析表明纯度均在93%之上。按此方法纯化，每升培养物可获得290 mg纯品rEAP，回收率为40%。

2.5 EAP活性分析

2.5.1 rEAP、EAP标记蛋白的反应速率及热稳定性试验

rEAP可催化对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）产生黄色对硝基酚，并且煮沸后重新复性的rEAP催化特性没有明显改变，而EAP与其他蛋白融合后反应性能略有下降（见图5）。

2.5.2 温度对酶促反应动力性质的影响

如图6所示，rEAP在25～65℃之间的催化性能均良好，且随反应温度升高酶活性显著升高，65℃时的活性约为25℃时的4倍。

2.5.3 rEAP的DNA去磷酸化试验

rEAP处理DNA前后的自连转化结果如图7所示。去磷酸化比未去磷酸化平板的自连转化子数量显著减少，表明重组子rEAP具有显著的移除DNA 5'端游离磷酸基团的能力。

图4 Ni-NTA亲和层析纯化EAP蛋白Fig.4 Recombinant EAP purification by affinity chromatography

图5 重组EAP、EAP融合蛋白浓度与反应速率及热稳定性试验Fig.5 Concentration,reaction rate and thermal stability test of recombinant EAP and EAP fusion protein

图6 温度对酶促反应动力的影响Fig.6 Effect of temperature on the enzyme kinetics

图7 重组EAP的DNA去磷酸化试验Fig.7 DNA dephosphorylation test of recombinant EAP

3 讨 论

近年，包括大肠杆菌K12在内的多株大肠杆菌的EAP基因得到克隆与活性研究[10-13]，而关于大肠杆菌标准菌株ATCC 25922的EAP基因的研究尚未见报道。本研究证实ATCC 25922 EAP具有典型的EAP酶活性。作为一个新的EAP成员，ATCC 25922 EAP功能的验证，丰富了人们对EAP的存在菌株以及催化活性等有关知识的进一步了解。

大肠杆菌碱性磷酸酶作为工具酶，可在基因连接中介导DNA去磷酸化反应。在ELISA等免疫学检测方法中作为信号分子也有广泛的应用。目前市场常见的AP产品中，CIAP（牛小肠AP）活性最高，约为天然EAP的40倍左右[13]。与提纯天然的CIAP相比，EAP具有成本低，热稳定性好，而且可以通过基因工程方法实现蛋白质的直接、定向标记等优点。并且由于EAP的催化活性与结构关系明确，可以方便的通过定点诱变等方法来提高EAP的酶活性。在后续研究中，本实验室拟将催化活性位点101位氨基酸D突变为S，及对其他活性位点进行诱变[10-12]，以期获得更高活性的rEAP。

本研究探索了重组ATCC 25922 EAP的纯化工艺，所表达的rEAP几乎全部可溶，并且具有典型AP酶活性。通过摸索金属亲和层析纯化rEAP的条件，得到了纯度达93%以上的rEAP，理论上每升LB培养基可得到290 mg的rEAP纯品。rEAP的酶热稳定性良好，100℃作用10 min后仍可恢复完全的酶活性，所耐受的工作温度范围也较为宽泛（25～65℃），因而可满足多种反应条件的需求。

本研究还证实rEAP具有作为标记酶或报告分子的潜力，并且可用于DNA去磷酸化反应，为ATCC 25922 rEAP作为免疫酶与信号酶的开发与应用提供了必要参考依据。

4 结论

本研究克隆并高效表达了E.coli ATCC 25922 EAP，初步探索了重组EAP的纯化工艺、酶活特性及应用方向，为ATCC 25922 EAP的后继开发与应用奠定了必要的基础。

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