盐胁迫对二倍体马铃薯叶超微结构的影响

张景云，白雅梅，于 萌，李文霞，吕文河*

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

马铃薯作为世界上主要粮食作物之一，其产量仅排在小麦、玉米和水稻之后，占第四位。由于马铃薯是对盐比较敏感的一种作物[1]，所以盐胁迫严重影响了马铃薯的生长发育，进而影响了马铃薯的生产。国内许多研究者在马铃薯耐盐性[1-4]、马铃薯脱毒苗生物产量及VC含量的变化[5]、耐盐相关生理指标的变化[6]及国外许多研究者在马铃薯耐盐方面做了较多的研究[7-10]，但从未见过有关盐胁迫对二倍体马铃薯细胞超微结构影响的报道。由于二倍体马铃薯中具有大量的抗性基因及优良品质性状基因[11-13]，因此从细胞水平上研究二倍体马铃薯的耐盐性具有非常重要的意义。本试验选取经12次轮回选择适应长日照的富利亚（Solanum phureja，PHU）与窄刀薯（S.stenotomum，STN）杂种（PHUSTN）无性系试管苗为材料，研究耐盐无性系和盐敏感无性系受盐胁迫后细胞超微结构上的差异，寻找耐盐性鉴定的指标，为筛选和培育马铃薯耐盐品种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究对45份二倍体马铃薯（PHU-STN）无性系试管苗进行了耐盐性筛选，筛选出耐盐和盐敏感的无性系，选取了其中耐盐性较强的无性系BD54-8和耐盐性较弱的无性系BD57-3为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 基础苗培养

2009年11月培养基础苗，取马铃薯脱毒试管苗，将其切成带1片叶的小茎段，插入装有MS培养基的100 mL三角瓶中，将其置于温度（25±2）℃，光照2 000～3 000 lx，每日光照16 h的条件下培养。

1.2.2 试验设计

培养基的配制：配制含有NaCl浓度为0、30 mmol·L-1的 MS培养基，pH 5.8，121℃灭菌 15 min。

材料的培养：取20 d苗龄的试管苗，单一节茎段培养，取中间茎段，长约1 cm，带有一个叶，每瓶插10个茎段，20 d后取材固定。

1.2.3 电镜样品的制备与观察

将所取叶片切成1 mm×3 mm的长方形，放入2.5%、pH 6.7的戊二醛中，于4℃固定24 h以上→pH 7.2磷酸缓冲液冲洗3次→2%四氧化饿固定1.5 h→pH 7.2磷酸缓冲液冲洗3次→酒精逐级脱水→100%乙醇与丙酮置换→环氧树脂812渗透、包埋→置于恒温箱内聚合→ULPRACUT-EXINXIN型超薄切片机切片→醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液25℃染色，H-7650型透射电子显微镜观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下细胞膜的变化

正常情况下被测的两个无性系的细胞膜清晰可见（见图1A、3A）。盐分胁迫下，BD57-3（见图4A）膜的结构被破坏，细胞膜部分向内波折折叠，而耐盐无性系BD54-8（见图2B）的细胞膜没有出现这种现象，说明盐敏感无性系BD57-3的细胞膜破坏比较严重。

2.2 盐胁迫下叶绿体结构的变化

耐盐无性系BD54-8和盐敏感无性系BD57-3在未经NaCl胁迫时，叶绿体具有双层膜，类囊体腔小且扁平，叶绿体紧贴在细胞边缘，呈长椭圆形，结构规则。基粒间有基质片层相连，片层排列紧密（见图1B、图3B）。

耐盐无性系BD54-8在30 mmol·L-1NaCl胁迫20 d后，叶绿体外形仍为长椭圆形，叶绿体中的基粒片质和基质片层几乎没有受到影响，片层扭曲不明显，叶绿体有空化的现象（见图2A）。

盐敏感无性系BD57-3在30 mmol·L-1NaCl胁迫20 d后，叶绿体结构受到了损伤，几乎缩成球形，边缘膜模糊，内部出现大而多的空化现象（见图4A），片层结构扭曲严重，基粒的类囊体片层数减少或解体，只能见到一些松散的片层结构（见图4B）。

2.3 盐胁迫下线粒体结构的变化

耐盐无性系BD54-8和盐敏感无性系BD57-3在未经NaCl胁迫时，线粒体的内、外膜及嵴清晰可见，围绕在叶绿体周围（见图1A、图3A）。

耐盐无性系BD54-8在NaCl胁迫20 d后，线粒体的内、外膜及嵴仍清晰可见，嵴部分模糊不清（见图2A、图2B）。

盐敏感无性系BD57-3在30 mmol·L-1NaCl胁迫20 d后，其线粒体内、外膜膨胀，难以辨认出内、外膜之间的界限。线粒体基质有些着色深，有些不着色，线粒体嵴均减少或者不明显，且发育较差（见图4A）。

图1 耐盐无性系BD54-8未经盐胁迫时质膜、叶绿体、基粒、线粒体的结构Fig.1 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt tolerant clone BD54-8 without salt stress

图2 耐盐无性系BD54-8经30 mmol·L-1NaCl盐胁迫后质膜、叶绿体、基粒、线粒体的结构Fig.2 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt tolerant clone BD54-8 with stressed at 30 mmol·L-1NaCl

图3 盐敏感无性系BD57-3未经盐胁迫时质膜、叶绿体、基粒、线粒体的结构Fig.3 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt sensitive clone BD57-3 without salt stress

图4 盐敏感无性系BD57-3经30 mmol·L-1NaCl盐胁迫后的质膜、叶绿体、基粒、线粒体的结构Fig.4 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt sensitive clone BD57-3 with stressed at 30 mmol·L-1NaCl

3 讨论与结论

盐胁迫下植物细胞膜系统受到破坏，特别是将引起叶绿体、线粒体超微结构发生不同程度的变化[14]。盐胁迫引起细胞器和膜结构破坏，其破坏程度决定了植物耐盐性的强弱，也是植物受到盐害的一个重要特征。耐盐性强的材料，细胞膜系统及细胞器的稳定性高，受到的破坏程度小。本试验结果表明，耐盐性强的无性系BD54-8细胞膜破坏程度小于盐敏感无性系BD57-3，这与刘爱峰等对大麦的研究结果相一致[15]，由于耐盐材料的细胞膜比较稳定，能够抵御盐胁迫对细胞结构的破坏，对盐胁迫表现出一定的忍耐力；盐敏感材料的细胞膜容易被破坏，从而功能丧失。叶绿体是感受盐胁迫最敏感的细胞器，正常情况下，叶绿体的内、外两层膜清晰可见，类囊体平行排列，基粒和基质片层排列规则有序。盐胁迫后，膜变得模糊，类囊体肿胀膨大，基粒和基质片层模糊。有学者对甘薯、马铃薯在盐胁迫下叶绿体的变化做了研究[10,16]。Smith等对不同耐盐生态型的匍茎翦股颖（Agrostis stolonifera）做了研究[17]，结果表明，不同耐盐生态型对NaCl的反应各不相同，盐胁迫破坏了盐敏感型细胞的线粒体结构，嵴的数目减少，线粒体膨胀，而耐盐生态型结构仍正常；水分胁迫下的玉米、盐胁迫下的小麦耐盐系愈伤组织和疫霉根腐病菌毒素对大豆根部的线粒体也表现出上述类似的结果[18-20]。因此，盐分胁迫对线粒体超微结构的影响，通常因植物耐盐性的不同而不同。

本试验从研究盐胁迫下细胞的超微结构出发，寻找衡量二倍体马铃薯耐盐性的强弱细胞学指标，结果表明，细胞膜、叶绿体和线粒体都可以作为衡量二倍体马铃薯耐盐性强弱的细胞学指标。

[1]龚家栋．马铃薯不同品种耐盐性差异初步研究[J]．中国沙漠,1996,16(1)∶61-66．

[2]尹江,马恢,崔红军．马铃薯亲本材料试管苗的耐盐性筛选[J]．中国马铃薯,2005,19(1)∶13-16．

[3]康玉林,张春震,夏佃仁,等．盐碱地马铃薯品种适应性研究[J]．马铃薯杂志,1997,11(1)∶7-10．

[4]李娟,程智慧,张国裕．马铃薯耐盐突变体的离体筛选[J]．西北农林科技大学学报∶自然科学版,2004,32(8)∶44-48．

[5]王新伟,滕伟丽,马异泉,等．盐胁迫下马铃薯脱毒苗生物产量及VC含量的变化[J]．东北农业大学学报,2000,31(3)∶221-224．

[6]张俊莲,陈勇胜,武季玲,等．盐胁迫下马铃薯耐盐相关生理指标变化的研究[J]．中国马铃薯,2002,16(6)∶323-327．

[7]KhraisT,LeclercY,DanielleJD．Relativesalinitytoleranceofpotato cultivars assessed by in vitro screening[J]．Amer J Potato Res,1998,75(5)∶207-210．

[8]Shaterian J,Waterer D R,De Jong H,et al．Methodologies and traits for evaluating the salt tolerance in diploid potato clones[J]．Am J Pot Res,2008,85∶93-100．

[9]Velasquez B,Balzarini M,Taleisnik E．Salt tolerance variability amongst Argentine Andean potato(Solanum tuberosum L．subsp.andigena)[J]．Potato Research,2005,4(4)∶59-67．

[10]Bruns S,Hecht-Buchholz C．Light and electron-microscope studies on the leaves of several potato cultivars after application of salt at various developmental stages[J]．Potato Res,1990,33∶33-41．

[11]RossH．Potato-breeding problems and perspectives[M]．Berlin∶Verlag Paul Parey,1986∶132．

[12]Murphy A M,De Jong H,Tai G C C．Transmission of resistance to common scab from the diploid to the tetraploid level via 4x×2x crosses in potatoes[J]．Euphytica,1995,82∶227-233．

[13]Watanable K,El-Nashaar H,Iwanaga M．Transmission of bacterial wilt resistance by FDR 2n pollen via 4x × 2x crosses in potatoes[J]．Euphytica,1992,60∶21-26．

[14]王茅雁,邵世勤,张建华,等．水分胁迫对玉米保护酶系活力及膜系统结构的影响[J]．华北农学报,1995,10(2)∶43-49．

[15]刘爱峰,赵檀方,段友臣．盐胁迫对大麦叶片细胞超微结构影响的研究[J]．大麦科学,2000(3)∶20-22．

[16]Mitsuya S,Takeoka Y,Miyake H．Effects of sodium chloride on foliar ultrastructure of sweet potato plantlets grown under light and dark conditions in vitro[J]．Plant Physiol,2000,157∶661-667．

[17]Smith M M,Hodson M J．Salt-induced ultrastructural damage to mitochondria in root tips of a salt-sensitive ecotype of Agrostis stolonifera[J]．Exp Bot,1982,23(5)∶86-895．

[18]Ciamporova M．Ultrastructure of cortical cells of maize root under water stress conditions[J]．Biologia Plant,1980(22)∶444-449．

[19]郑文菊,王勋陵,贾敬芬．西安小麦耐盐系愈伤组织细胞的超微结构观察[J]．西北植物学报,1999,19(1)∶81-84．

[20]徐鹏飞,张淑珍,吴俊江,等．大豆疫霉根腐病菌毒素对抗感不同大豆品种根部超微结构的影响[J]．东北农业大学学报,2009,40(4)∶1-5．