浊度法测定四环素片效价的可行性研究

彭素梅 李洪波

四环素是从放线菌金色链丛菌(streptomyces aureofaciens)的培养液等分离出来的抗菌物质，对革兰阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，是一种广谱抗菌素。对于四环素效价的测定，《中国药典))2005年版采用管碟法［1］。管碟法操作繁琐，耗费时间长，影响因素多，重现性差，采用浊度法测定可克服以上不足［2］。本文建立了利用浊度法测定四环素片效价的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 WBS-100全自动微生物比浊法测定仪及石英培养杯(北京先驱威锋技术开发公司)，R200D电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 菌株、样品、培养基及试剂 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］由中国药品生物制品检定所提供;四环素标准品(批号:130306-200317，970 μg/mg)由中国药品生物制品检定所提供;四环素片(批号:0806007;0808011;0810012)由北京康蒂尼药业有限公司提供。

抗生素检定培养基Ⅱ号(pH6.5，批号070603)由北京三药科技开发公司提供;抗生素检定培养基Ⅲ号(pH7.0，批号070105)由北京三药科技开发公司提供;灭菌0.9%氯化钠溶液和磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)均按中国药典2005年版二部附录3配制。其他试剂均为分析醇。

2 实验方法

2.1 菌液的配制取 金黄色葡萄球菌斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，置35℃ ～37℃培养18～22 h，用灭菌生理盐水洗下菌苔，加生理盐水稀释，使其在530 nm波长处的吸光度约为1.0。取菌液0.3 ml加至100 ml抗生素检定培养基Ⅲ中，摇匀，为实验菌液。

2.2 标准品贮备溶液的配制 精密称取四环素标准品26.20 mg，置25 ml量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容，作为标准品贮备液。用磷酸盐缓冲溶渡(pH6.0)按剂距比 1.5∶1 进一步稀释成 0.06、0.09、0.13、0.2、0.3 μg/ml的标准品溶液。

2.3 供试品溶液的配制 取四环素片样品10片，研细，精密称取适量(约相当于红霉素100 mg)，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解后，室温密闭放置过液，精密量取上清液，作为供试品贮备溶液。试验时精密四环素片储备液适量，用磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)稀释成0.2和0.1 μg/ml的供试品溶液。

2.4 培养与测定 采用标准曲线法测定。取系列标准品溶液和供试品溶液各1.0 ml，按拉丁方排列分别加入灭菌培养管中，再加入实验菌液9.0 ml，置微生物比浊法测定仪内，于37℃培养。另取稀释溶剂1.0 ml，加9.0 ml空白培养基，混匀，作为空白对照。仪器在位于530 nm波长处测定各管金黄色葡萄球菌对数生长期内小同培养时间下的吸光度值(A)。以标准品溶液浓度的对数值为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，按标准曲线法汁算供试品的效价值。

3 结果

3.1 线性实验 在0.05～0.33 μg/ml范围内做线性实验。分别精密苗取上述四环素系列标准品溶液各1.0 ml，置灭菌比色皿中，每个浓度5管，分别加入实验菌液9.0 ml，立即摇匀，置抗生素比浊法测量仪内，于(37±1)℃培养4 h，在530 nm处测定吸收度，计算标准曲线。结果显示，抗生素浓度在0.06～0.3 μg/ml时，吸光度值A与抗生素浓度对数呈良好的线性关系，回归方程为Y=bX+a=-0.3002X-0.0316(相关系数r=0.9968)，在此范围内可设计用标准曲线法测定四环素的含量。

3.2 回收率实验 分别精密量取四环素标准品加入到已测定浓度的四环素片样品溶液中，加0.1 mol/L盐酸溶液配制成浓度为0.08、0.10及0.12 μg/ml混合溶液各3份，按2.4方法测定回收率。平均回收率为99.22%(n=9)，RSD=1.7%。结果见表1。

表1 四环素片加样回收试验结果(n=9)

表2 比浊法与管碟法测定四环素效价的结果比较

3.3 与管碟法的比较 取3批四环素片样品按2.4方法和中国药典2005年版二部四环素片含量测定项下管碟法测定其效价，将结果进行比较，见表2。

4 讨论

中国药典2005年版二部收载四环素效价测定采用管碟法［1］。管碟法能直观反应样品的体外抗菌能力，一直被广泛应用。但因其操作繁琐，实验时间长，影响因素多，浊度法可以克服管碟法的不足，且根据我科室采用两种方法比较，浊度法与管碟法结果基本一致。

但浊度法也应注意操作的规范性，如菌液培养时间的一致性，主要是使每管的培养时间相等，实验时在试管中加入含试验菌液的培养基后，应立即加入标准品溶液和供试品溶液，混合均匀;浊度法对试验仪器的性能要求较高，主要体现在培养室的温度偏差，要求培养温度一致;另外比色管的清洁度也会给测定结果带来影响。但浊法快速、易于操作，采用液体培养基，消除了多组分抗生素在固体培养基中扩散不同的影响，使得试验的灵敏度高，精密度和准确度都较琼脂扩散法好。而且用同定波长测定菌液的吸光度其精密度优于管碟法中对抑菌圈的测定。

［1］国家药典委员会，中国药典(二部)．化学工业出版社，2005．

［2］张治锬．抗生素药品检验．人民卫生出版社，1987:80-97．