重组人血管内皮抑素联合放疗对小鼠肾癌移植瘤的协同抗瘤效应研究

白晋阳 邢月明 吴伟

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，占所有成人恶性肿瘤的2%～3%。世界范围内，肾癌的死亡病例每年超过100000例［1］。既往临床发现约有20% ～30%的患者确诊时己有远处转移，治疗效果和预后不甚理想。本实验创新性的利用重组人血管内皮抑素(恩度)联合放疗治疗小鼠肾癌移植瘤，观察两者对小鼠肾癌是否有协同抗瘤效应。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备 48只6周龄BALB/c雌性小鼠及renca肾癌细胞株由中科院肿瘤医院提供;恩度由先声药业公司惠赠;免疫组化试剂盒购于北京博奥深生物技术有限公司;山西医科大学第二医院肿瘤科提供Co60放射治疗机。

1.2 实验方法及相应处理

1.2.1 动物模型的建立与分组 取传代14 d的renca肾癌荷瘤小鼠2只，处死后剥离肿瘤制成细胞悬液，调整密度为1.0×107个/ml。在每只小鼠右后肢外侧皮下注射细胞悬液0.2 ml。各组均正常喂养，待小鼠皮下种植瘤体积达0.4 cm3左右时，将48只荷瘤小鼠随机分组:①对照组，生理盐水腹腔注射，自放疗开始日连用14 d;②恩度组，恩度按10 mg/(kg·d)腹腔注射，自放疗开始连用14 d;③放疗组，清醒状态下固定，对每只小鼠右后肢肿瘤局部照射，放疗剂量为5 gy/次，隔日进行，共4次;④恩度+放疗组，恩度和放疗方法剂量同上。

1.2.2 移植瘤的疗效观察 观察荷瘤鼠一般情况。每隔一天专人用游标卡尺测量肿瘤的最大长径(A)和与之垂直的最大宽径(B)，体积(V)=1/6AB2π(A大于B)计算各组小鼠肿瘤平均体积，比较各组小鼠肿瘤的生长情况并绘制肿瘤生长曲线。

1.2.3 移植瘤病理形态观察 实验结束后7 d处死小鼠，取肿瘤组织，常规HE染色，观察肿瘤组织情况。用兔抗鼠VEGF作为一抗，按照试剂盒说明书进行SABC法免疫组织化学染色。VEGF表达阳性肿瘤细胞的细胞质经处理后可被标记为棕黄色，随机选取5个肿瘤外周区域，计数高倍镜(×400)下染色阳性的肿瘤细胞并取均值，计算其与同一视野下肿瘤细胞总数均值的比例作为肿瘤细胞VEGF表达阳性率(%)。CD34代替VEGF抗体作为Ⅰ抗，阴性对照用PBS代替。MVD计数按Weidner［2］的评判标准进行。

1.3 统计学方法 利用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以均值±标准差(±s)表示，多个样本间均数比较采用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。应用Excel 2003软件进行绘图。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状况 放疗+恩度组较其余各组小鼠反应灵敏，活动多，毛色光亮;对照组小鼠反应最迟钝，活动较少，常抱成团。

2.2 各组小鼠移植瘤体积增长曲线 随着时间的增长，各组小鼠移植肿瘤的体积越来越大，对照组小鼠的肿瘤生长速度最快，余各组小鼠的肿瘤生长速度逐渐减缓，明显受到抑制，以放疗+恩度组对体积抑制作用最强 (图1)。

图1 各组小鼠移植癌体积增长比较

2.3 常规HE染色 光镜下观察瘤组织的形态学变化，对照组癌细胞生长旺盛，核浓染，癌细胞几乎不见坏死。放疗+恩度组癌组织存在大量异型细胞，这些细胞呈片状分布，细胞核染色较轻、固缩、坏死，坏死的肿瘤细胞较其他组均明显增多，可见较广泛的大片状坏死。

2.4 肿瘤细胞VEGF表达阳性率 免疫组化结果显示VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质，阳性染色表现为胞浆内均匀棕黄色细颗粒状染色。放疗+恩度组的肿瘤细胞VEGF表达阳性率最低，其余各组肿瘤细胞VEGF表达阳性率差异均具有统计学意义(P＜0.05)(表2)。

表2 放疗和恩度四种组合的VEGF表达均值和标准差(± s，%)

表2 放疗和恩度四种组合的VEGF表达均值和标准差(± s，%)

放疗 恩度不使用 使用不使用32.28±2.25 22.81±3.07使用49.64±2.31 8.17±1.05

表3 放疗和恩度四种组合的MVD值均值和标准差(±s，个/200P)

表3 放疗和恩度四种组合的MVD值均值和标准差(±s，个/200P)

放疗 恩度不使用 使用不使用36.68±3.06 6.01±1.86 24.35±1.28 16.33±1.52使用

2.5 组织微血管密度 肿瘤组织切片中，微血管密集区多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位。CD34显色主要位于细胞的胞浆、核膜上，为棕黄色或褐色颗粒。放疗+恩度组的肿瘤内微血管密度(MVD值)最低，各组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)(表3)。

3 讨论

目前认为肾癌放疗效果差的原因除了细胞遗传特异性外，实体瘤内普遍含有的对放射线抗拒的乏氧细胞也起很重要的作用。研究表明乏氧细胞的放射敏感性只有含氧细胞的1/3，对放射线的耐受性比有氧细胞强。有研究［3-4］表明抗血管生成类药物与放疗联用，一方面，可以协同放疗致敏血管内皮细胞，杀伤肿瘤内部血管，并阻止放疗后由于生长因子表达的增加所致血管再生，从而减少肿瘤血供，促进其坏死;另一方面，由于放疗杀伤细胞依赖于氧自由基，其疗效和肿瘤内部氧分压成正相关，而抗血管生成类药物可导致肿瘤异常血管正常化，促进新生血管的内皮管腔的稳定和成熟，提高肿瘤内部氧分压，从而增强放疗对癌细胞的杀伤作用。恩度是由我国学者罗永章等自主研发的一种可溶性新型重组人血管内皮抑素，具有广谱抗血管生成活性。本实验创新性的应用恩度联合放疗，与单药恩度、单纯放疗对小鼠Renca肾癌疗效对比。通过观察小鼠一般状况和肿瘤生长曲线可以看出放疗和恩度均抑制了肿瘤的生长，但它们的作用机理不同。两者联合组肿瘤体积明显缩小，说明两者通过不同的途径抑制肿瘤的效应可以叠加。免疫组化SABC法检测结果显示单纯放疗组肿瘤细胞VEGF(32.28±2.25)及微血管密度MVD(24.35±1.28)表达最高，说明放疗后确实能导致肿瘤新生血管增加从而对进一步的放疗产生耐受。而放疗联合恩度组无论肿瘤细胞VEGF阳性率(8.17±1.05)还是肿瘤微血管密度(6.01±1.86)与各组相比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，且与单纯放疗组相比明显减少，充分说明了恩度联合放疗通过减少了小鼠Renca肾癌新生血管的生成，而起到了协同抗瘤效应。但本实验为鼠源性肿瘤，且样本例数较少，要想今后应用在人类肾癌尚需要进一步的研究。

［1］Patel PH，Chaganti RS，Motzer RJ.Targeted therapy for metastatic renal cell carcinoma.Br J Cancer，2006，94:614-619.

［2］Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis is a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma.Natl Cancer Inst，1992，84(24):1875-1887.

［3］罗威，刘景晶.抗血管生成类药物与放疗协同作用的临床前研究现状 .药学进展，2008，32(11):488-493.

［4］Ergun S，Kilic N，Wurmbach J H，et al.Endostatin inhibit sangi genesis by stabilization of newly formed endothelial tubes.Angiogenesis，2001，4(3):193-206.