新清宁片微生物限度检查方法研究

李 霞，董卫红，韩曼雪，关 键

(中国中医科学院实验药厂，北京 100700)

新清宁片微生物限度检查方法研究

李 霞，董卫红，韩曼雪，关 键

(中国中医科学院实验药厂，北京 100700)

微生物限度检查法;验证;新清宁片

新清宁片是由熟大黄粉组成。熟大黄粉具有抑菌作用，按照《中国药典》2005年版［1］1部附录微生物限度检查方法常规法检查，部分细菌的回收率小于70%，达不到规定的要求。本文细菌检查法采用培养基稀释法，霉菌、酵母菌、控制菌检查法均采用常规法。

1 材料

1.1 培养基

pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)，均按照《中国药典》2005年版1部附录要求配制。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］均符合《中国药典》2005年版1部附录要求。

1.3 供试品

新清宁片，批号090202。

2 方法

2.1 菌液的制备

取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，35℃ ～37℃培养18h～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含菌数为50cfu～100cfu的菌液备用;取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，23℃ ～28℃培养24h～48h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至菌液浓度为每1ml含菌数为50cfu～100cfu。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃ ～28℃培养5d～7d，加0.9%无菌氯化钠溶液3ml～5ml洗下霉菌孢子，吸出孢子液，取1ml孢子液至0.9%无菌氯化钠溶液9ml中，使菌液浓度为50cfu/ml～100cfu/ml。

2.2 细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证

2.2.1 供试品溶液的制备 取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶10的供试液。取1ml置pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液9ml中，即为1∶100的供试液。

2.2.2 微生物限度回收率测定 菌液组:分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、黑曲霉、白色念珠菌的菌液 1ml(含50～100cfu)，采用平皿计数法，含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的实验平皿倾注营养琼脂培养基，置30℃ ～35℃培养48h，计数;白色念珠菌、黑曲霉的实验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23℃～28℃培养72h，计数。测定菌液中每毫升的活菌数。样品对照组:取1∶100供试液1ml，倾注营养琼脂培养基，置30℃ ～35℃培养48h，测定供试品本底的细菌数;取1∶10供试液1ml，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23℃ ～28℃培养72h，测定供试品本底的霉菌和酵母菌数。实验组:取1∶100的供试液1ml和上述细菌菌液1ml(含50cfu～100cfu实验菌)，分别注入同一平皿中，倾注营养琼脂培养基，置30℃～35℃培养48h，进行细菌计数和回收率计算。取1∶10的供试液1ml和上述真菌菌液1ml(含50cfu～100cfu实验菌)，分别注入同一平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23℃ ～28℃培养72h，进行霉菌和酵母菌计数和回收率计算。回收率(%)=(实验组细菌数－样品本底菌数)/验证加菌数。实验结果如下。

表1 微生物限度回收率测定

2.3 控制菌检查方法的验证

2.3.1 大肠埃希菌 接种大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃ ～37℃培养18h～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每 ml含菌数为10cfu～100cfu的菌液备用。

供试液的制备:取本品10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试液分散均匀，制成1∶10的供试液，取1ml置pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9 ml中制成1∶100的供试液，以此类推，至1∶1000的供试液。

验证方法:供试品组:取1∶10的供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，置35℃ ～37℃培养18h～24h。空白对照组:取稀释液10ml，加至胆盐乳糖培养基 100ml中，置 35℃ ～37℃ 培养 18h～24h。阴性菌对照组:取 1∶10的供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，加入金黄色葡萄菌10cfu～100cfu，置35℃ ～37℃培养 18h～24h。阳性对照菌组:取1∶10的供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，加入大肠埃希菌10cfu～100cfu，置35℃ ～37℃培养18h～24h。取上述培养物0.2ml，分别加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35℃ ～37℃培养5h～24h并观察结果。

表2 控制菌检查结果

结果显示，阳性菌生长良好，表明供试品在该实验条件下对大肠埃希菌没有抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不计。阴性菌均未检出，表明该方法的专属性好，说明采用上述方法进行本品的大肠埃希菌检查可行。

2.3.2 大肠菌群 供试品组:取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1∶10的供试液1ml、1∶100 供试液 1ml、1∶1000 供试液 1ml，作为供试品组。验证方法:空白对照组:取与供试液等量的稀释剂加入10ml的胆盐乳糖发酵培养基管中作为空白对照组。阴性菌对照组:取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入上述1∶10的供试液1ml、1∶100 供试液 1ml、1∶1000 供试液 1ml，分别加入金黄色葡萄球菌10cfu～100cfu作为阴性对照组。取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入上述 1∶10 的供试液 1ml、1∶100 供试液 1ml、1∶1000供试液1ml，分别加入大肠埃希菌10cfu～100cfu作为阳性对照组。将上述培养基管置35℃ ～37℃培养18h～24h，结果如下。

表3 各对照组配置比例配比

结果显示，阳性菌生长良好，表明供试品在该实验条件下对大肠菌群的代表菌大肠埃希菌无抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不计;阴性菌均未检出，表明该控制菌检查方法的专属性好，说明采用此方法进行本品的大肠菌群检查可行。

3 结论

我们按照《中国药典》2005年版1部微生物限度检查法中常规法检验。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、黑曲霉、白色念珠菌实验菌的回收率均大于70%。按照《中国药典》2005年版1部微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。控制菌检查阳性菌生长良好，说明本品对大肠埃希菌、大肠菌群没有抑菌作用。阴性菌均未检出，表明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典2005年版［S］.北京:化学工业出版社.

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0825-02

2010-01-10