环境因素对痹证大鼠自身抗体表达的影响

申洪波，白云静，胡荫奇

(1.北京大学第三医院，北京 100191;2.北京军区总医院，北京 100700;3.中国中医科学院 望京医院，北京 100102)

环境因素对痹证大鼠自身抗体表达的影响

申洪波1，白云静2，胡荫奇3

(1.北京大学第三医院，北京 100191;2.北京军区总医院，北京 100700;3.中国中医科学院 望京医院，北京 100102)

目的:研究环境因素对痹证大鼠类风湿关节炎(RA)相关自身抗体表达及关节破坏程度的影响。方法:32只大鼠随机分为对照组、模型组、寒湿组和湿热组，除对照组外其余3组造模后给予相应环境刺激。结果:第2、4周时，模型组、寒湿组和湿热组大鼠血清RF、anti-CCP滴度及 AKA、APF阳性率均明显高于对照组，4周时 AKA、APF阳性率明显高于模型组和寒湿组(P均<0.05);湿热组、寒湿组大鼠骨破坏严重。结论:环境因素影响了大鼠RA相关自身抗体表达和关节破坏程度。

类风湿关节炎;自身抗体;环境因素;实验研究

类风湿关节炎属中医痹证范畴，中医学认为痹证的形成与环境因素密切相关。为研究环境因素与类风湿关节炎相关自身抗体表达的关系，笔者用完全福氏佐剂及人工合成CCP多肽免疫动物，并给予寒湿和湿热环境刺激，观察了环境因素对RA相关自身抗体表达的影响以及对RA关节破坏的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组

选取适龄健康雌性SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供，SCXK(京)2002-0003)32只，依照随机数字表法随机分为正常对照组(对照组)、佐剂+CCP抗原组(模型组)、佐剂 +CCP抗原+寒湿环境组(寒湿组)、佐剂+CCP抗原+湿热环境组(湿热组)共4组，每组8只。

1.2 主要试剂和仪器

人工合成 CCP多肽，由岳泰公司提供;CCPELISA检测试剂盒、AKA-ELISA检测试剂盒、RFELISA检测试剂盒均由欧盟公司提供;FPQ型多段人工气候箱，购自宁波莱福科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制作 模型组:使用人工合成的CCP多肽抗原 100μg～150μg与完全福氏佐剂0.1ml混合后，注射一组大鼠双侧后肢足底部制备模型;寒湿组:免疫方法同模型组，并在接受免疫后第2天始，每天置于相对湿度95% ～100%、温度7℃ ～10℃的环境中2h，连续刺激9d;湿热组:免疫方法同模型组，并在接受免疫后第2天始，每天置于相对湿度 95% ～100%、温度 30～33℃的环境中2h，连续刺激9d;对照组不做任何处理。

1.3.2 标本处理 以上各组均于实验开始2周后尾尖取血1ml制备血清备用;4周后心脏穿刺取血4ml～6ml，制备血清备用;②造模后第4周末处死大鼠，取双侧后肢踝关节，多聚甲醛固定、脱钙、脱水、浸腊、包埋、切片，HE染色后以备镜下观察。

1.3.3 观察指标 双侧后肢跖趾厚度:使用千分卡尺分别测量大鼠双侧后肢跖趾厚度，取其双侧平均值。类风湿相关自身抗体检测:包括类风湿因子(RF)(ELISA法)、抗角蛋白抗体(AKA)(间接免疫荧光法)、抗核周因子(APF)(间接免疫荧光法)、抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-CCP)(ELISA法)。病理学检测:HE染色后镜下观察大鼠踝关节的关节结构变化情况。

图1 大鼠后肢踝关节HE染色湿热组

图2 大鼠后肢踝关节HE染色寒湿组

图3 大鼠后肢踝关节HE染色模型组

图4 大鼠后肢踝关节HE染色对照组血清AKA表达情况

1.4 统计分析方法

所有资料均采用SAS8.0统计软件进行分析，等级资料采用秩和检验和ridit分析，计量资料用方差分析，各时间点比较采用具有一个重复测量的两因素方差分析。

2 观察结果

2.1 各时间点大鼠双侧后肢跖趾平均厚度比较

表 1 显示，实验各组在实验前、6d、12d、18d、24d、28d等6个时间点大鼠双侧后肢跖趾厚度比较显示，实验前各组跖趾厚度无显著性差异(P>0.05);其余5个时间点各组均值之间比较均有统计学意义(P均<0.01)。组间两两比较显示:从第6天开始，模型组、寒湿组和湿热组在各个时间点均明显高于对照组(P均<0.01);从第24天开始，寒湿组和湿热组在各个时间点也均高于模型组(P均<0.05);但湿热组和寒湿组之间无显著性差异(P均>0.05)。组内两两比较显示:对照组各个时间点之间均无显著性差异(P均 >0.05);模型组第6天及以后的各个时间点均明显高于观察前(P均<0.01)，其余各个时间点之间无显著性差异(P均>0.05);寒湿组第6天及以后的各个时间点均明显高于观察前(P均<0.01)，第28天分别高于第6天和第12天(P均<0.05)，其余各个时间点之间无显著性差异(P均>0.05);湿热组第6天及以后的各个时间点均明显高于观察前(P均<0.01)，第28天分别高于第6天和第12天(P均<0.05)，其余各个时间点之间无显著性差异(P均>0.05)。

2.2 血清RF和抗CCP检测结果

表2显示，实验2周末、4周末模型组、寒湿组和湿热组大鼠血清RF水平均明显高于对照组(P均<0.05);2周末寒湿组和湿热组又均明显高于模型组(P均<0.05)，但寒湿组和湿热组之间差异无统计学意义(P>0.05);4周末模型组、寒湿组和湿热组比较无统计学差异(P均>0.05)。

表2显示，实验2周末、4周末模型组、寒湿组和湿热组大鼠血清CCP抗体滴度均明显高于对照组(P均<0.05);2周末、4周末寒湿组和湿热组又均明显高于模型组(P均<0.05)，但寒湿组和湿热组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。

表 1 实验前、6d、12d、18d、24d、28d 各组跖趾厚度检测结果(mm，±s)

表 1 实验前、6d、12d、18d、24d、28d 各组跖趾厚度检测结果(mm，±s)

注:与对照组比较:★P<0.01;与模型组比较:▲P<0.05;与观察前比较:■P<0.01;与第6天比较:#P<0.05;与第12天比较:◇P<0.05

时间(d)对照组(8) 模型组(8) 寒湿组(8) 湿热组(8)实验前4.35±0.24 4.52±0.15 4.46±0.29 4.35±0.34 6 4.43±0.25 6.76±0.99★■ 6.55±1.32★■ 6.63±0.82★■12 4.54±0.20 6.21±0.52★■ 6.50±0.31★■ 6.88±0.62★■18 4.61±0.29 7.11±0.75★■ 7.39±0.59★■ 7.48±0.33★■24 4.63±0.24 6.42±0.83★■ 7.39±0.44★▲■ 7.50±0.46★▲■28 4.89±0.27 6.40±0.33★■ 7.91±0.74★▲■#◇ 7.83±0.43★▲■#◇

表2 RF和抗CCP表达情况

图5 湿热组AKA(+++)

图6 寒湿组AKA(++)

图7 模型组AKA(+)

图8 对照组AKA(－)

2.3 血清AKA表达情况检测结果

表3显示，实验2周末、4周末，模型组、寒湿组和湿热组大鼠血清AKA的阳性率均明显高于对照组(P均<0.05);4周末湿热组血清AKA阳性率明显高于模型组和寒湿组(P均<0.05)，但寒湿组和湿热组之间无显著性差异(P>0.05)。

2.4 血清APF表达情况检测结果

表4显示，实验2周末、4周末，模型组、寒湿组和湿热组大鼠血清APF的阳性率均明显高于对照组(P均<0.05);4周末湿热组血清APF阳性率明显高于模型组和寒湿组(P均<0.05)，但寒湿组和湿热组之间无显著性差异(P>0.05)。

注:与对照组比较:★P<0.05;与模型组比较:▲P<0.05;与寒湿组比较:#P<0.05

表4 2周末、4周末APF表达情况

2.5 病理学检测结果

对照组:关节结构正常，滑膜组织无炎性细胞浸润，滑膜细胞无增生，骨及软骨结构正常;模型组:关节结构基本正常，滑膜细胞轻度增生，骨及软骨结构基本正常;寒湿组:滑膜组织增生，可见3～4层排列不规则的滑膜细胞及炎性细胞浸润，骨小梁稀疏，髓腔扩大;湿热组:滑膜细胞增生明显，可见数层排列不规则的滑膜细胞及炎性细胞浸润，骨小梁稀疏、断裂，排列不规则。

3 讨论

中医学认为，人体是一个有机整体，人和环境之间相互影响，也是一个不可分割的有机整体。《素问·六节脏象论》曰:“天食人以五气，地食人以五味，五气入鼻，藏于心肺，上使五色修明，音声能彰;五味入口，藏于肠胃，味有所藏，以养五气，气和而生，津液相成，神乃自生。”《素问·宝命全形论》云:“人以天地之气生，四时之法成”，说明自然环境乃人类生命赖以生存的源泉，同时人类作为整个物质世界的一部分，时刻受到自然环境变化的影响。正如《灵枢·邪客论》所言:“此人与天地相应者也。”类风湿关节炎属中医痹证范畴，正如《黄帝内经素问·痹论》中所说“风寒湿三气杂至合而为痹也，其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹。”可见，痹病与环境的关系尤为明显。现代医学认为，虽然RA的病因在很大程度上还不明确，然而RA很可能是一种多因子疾病包括遗传因素和环境因素。甚至有的学者认为，在RA发病过程中环境因素起了至关重要的作用，这种作用甚至超过遗传因素。近年来随着免疫学的进展，类风湿关节炎相关自身抗体的发现，对类风湿关节炎的早期诊断和预后都有很大帮助。多数学者认为，anti-CCP、APF、AKA的表达与类风湿关节炎关节破坏程度有关。然而，类风湿关节炎自身抗体的表达与中医证候之间的关系如何?环境因素是否影响类风湿关节炎自身抗体的表达?本实验在佐剂性关节炎模型的基础上，用人工合成 CCP多肽抗原免疫动物，结合环境因素制作动物模型，观察了不同环境下动物模型自身抗体表达的情况及关节破坏程度。

本研究显示，①造模从实验第6天起对大鼠后肢跖趾厚度具有非常显著性影响，湿热和寒湿环境更加重了对大鼠后肢跖趾厚度的影响，且随着时间的推移，这种影响逐渐加重，但湿热和寒湿环境之间无显著性差异;②造模加寒湿或湿热环境刺激能使大鼠血清RF水平显著升高，但湿热与寒湿环境之间比较无统计学差异;③造模加寒湿或湿热环境刺激能使大鼠血清CCP抗体滴度显著升高，但湿热与寒湿环境之间比较无统计学差异;④造模或造模加寒湿或湿热环境刺激均能使大鼠血清AKA、APF阳性率明显高于对照组，其中造模加湿热环境的阳性率最高，造模加寒湿环境次之，但与单纯造模无显著性差异;⑤病理 HE染色显示，模型组、寒湿组和湿热组均可见关节滑膜细胞增生及炎性细胞浸润，其中模型组最轻，湿热组关节破坏最重，可见数层排列不规则的滑膜细胞及炎性细胞浸润，寒湿组介于2组之间，

上述研究提示，寒湿和湿热等环境因素影响了动物模型血清中 RF、anti-CCP、APF、AKA 的表达，加重了动物模型的自身免疫反应和关节炎的严重程度，其中湿热环境的影响更为明显。湿热组关节破坏最重，RF、anti-CCP、APF、AKA 的表达均显著增高或表达强阳性，特别是AKA和APF表达与关节破坏程度有关。从中可得出结论，寒湿和湿热环境因素明显影响了大鼠佐剂性关节炎的发病及严重程度，促进了疾病的发生，并加重了关节炎的病理进程。

本实验显示，寒湿和湿热环境对大鼠跖趾厚度、自身抗体表达及关节破坏程度均有明显影响，其中湿热环境对大鼠血清AKA和APF影响及对关节破坏程度的影响更为严重，原因尚不清楚。但我们在实验过程中发现，在寒湿环境中大鼠经常簇拥在一起取暖，这可能减缓了寒湿环境对其发病的影响，所以究竟寒湿和湿热环境对RA发病的影响孰轻孰重，两种环境对RA相关自身抗体表达的影响有何不同，两种环境下的动物模型与中医湿热证和寒湿证是否一致，还有待进一步研究。

Effect of Environmental Factors on Expression of Autoantibody in Rats with Bi-Syndrome(Arthromyodynia)

SHEN Hong-bo1，BAI Yun-jing2，HU Yin-qi3
(1.Peking university third hospital，Beijing100191，China;2.The military general hospital of Beijing PLA，Beijing100700，China;3.Wangjing hospital of China academy of Chinese medical science，Beijing100102，China)

Objective:To study the impact of environmental factors on expression of autoantibodies in arthragia syndrome rats.Methods:32 SD rats were randomly divided into control group，model group，damp-cold group or damp-heat group.In addition to the control group，the other 3 groups after modeling were put into different environmental for stimuli.Results:Compared with model group，the RF，APF and anti-CCP levels of both damp-heat group and damp-cold group showed statistically significant increase(P<0.05)，after both two and four weeks.Two weeks later，compared with model group，the AKA level of both damp-cold and damp-heat group showed statistically significant increases(P<0.05).4 weeks later，the AKA level had statistically significant increase compared with not only model group but also damp-cold group(P<0.05).The pathological results(4 weeks later)illustrated that the joint damage of rats from both damp-heat and damp-cold group were severer than that from model group and the joint damage of rats from damp-heat group were obviously the most serious.

rheumatoid arthritis，autoantibody，environmental factors，experimental study

R593.22

B

1006-3250(2010)09-0832-03

2010-03-17

申洪波(1966-)，男，山东潍坊人，医学博士，主治医师，从事中医药治疗风湿免疫性疾病的临床和实验研究。Tel:010-82266267，18601227122，E-mail:shenhbo@yahoo.com.cn。