衣霉素抑制细胞周期蛋白D1表达而强化TRAIL诱发凋亡的实验研究

解继胜，张海燕，都镇先，邓娓娓，王华芹

（1.右江民族医学院 组织胚胎学教研室，广西 百色 533000；2.中国医科大学 附属第一医院老年病干诊科；3.中国医科大学 附属第一医院内分泌科，沈阳 110001；4.中国医科大学 基础医学院生化与分子生物学教研室，沈阳 110001）

近来研究显示［1］肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）能诱导许多肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞基本没有影响，因而可能成为很有前景的抗癌药。但甲状腺恶性肿瘤细胞对TRAIL的敏感性具有相当的异质性［2，3］。因此，TRAIL 凋亡诱导增敏剂的发现将能有效扩展TRAIL的肿瘤治疗效应。衣霉素是一种天然抗生素，阻止细胞内N端连接寡糖类生物合成的第一步，曾用于TRAIL自发性耐药前列腺癌和获得性耐药大肠癌治疗［4］，但其增加TRAIL抗肿瘤作用分子机制尚未阐明。为此，本研究以人甲状腺未分化癌细胞为对象，通过TRAIL单用及联用衣霉素，探讨衣霉素对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的增敏效应及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

甲状腺未分化癌ARO细胞株和正常甲状腺上皮细胞株HTori-3分别由美国标准生物品收藏中心和欧洲标准生物品收藏中心提供。衣霉素和可溶性TRAIL分别购于Sigma公司和R&D公司。以下抗体用于蛋白印记分析：γ-tubulin（Sigma公司），phospho S249 Rb（Abcam 公司），cyclin D1（Santa Cruz生物工程公司）。ECL试剂盒（英国Amersham生命科学公司）；脂质体2000转染试剂（Invitrogen公司）。

1.2 细胞培养及分组

2种细胞均于含10%胎牛血清1640（sigma公司）培养基中、37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，2～3 d传代1次，均选用对数生长期细胞进行实验。按干预因素将甲状腺未分化癌细胞ARO分为TRAIL组、衣霉素组、TRAIL+衣霉素组（联合用药组）；同时以正常甲状腺上皮细胞株HTori-3为对照（对照组）。单药组为向细胞中分别加入 0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 μg/ml TRAIL 和 0，1，2.5，5，10，20 μg/mL 衣霉素作用24或48 h；联合用药组为用5 μg/mL衣霉素预处理 24 h 后，应用 0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 μg/ml TRAIL处理细胞24 h。

1.3 细胞凋亡检测

按照厂商说明利用膜联蛋白-PE凋亡检试剂盒I（BD Bioscience）检测细胞死亡，然后经荧光活性细胞扫描（FACScan）流式细胞仪分析（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）。每次试验至少计数 500 个细胞核，所有试验均进行3次。

1.4 流式细胞计数法

细胞经70%乙醇固定，PBS再水化，碘化丙锭（Sigma）染色，然后利用流式细胞计数法（FACScan，Becton Dickinson）分析DNA容量。细胞周期分布通过ModFit软件（Verity Software House）分析。流式细胞仪对各组细胞DNA含量进行分析，2N峰代表G0/G1期，交叉峰代表S期，4N峰代表G2/M期。

1.5 Western blot检测多种蛋白表达

收集各组细胞，裂解破碎离心后，测上清蛋白浓度，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转移法转至硝酸纤维素（PVDF）膜上，以5%脱脂奶粉TBST封闭后，依次加入一抗phospho S249 Rb，cyclin D1；以γ-tubulin为内对照，4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，然后参照ECL试剂盒说明进行化学发光显像。

1.6 微小RNA干扰（siRNA）

本实验应用的微小干扰RNA序列如下：抗细胞周期蛋白D1 的 siRNA（sicycD1），GUUCAUUUCCAAUCCGCCC；乱序的无意义 siRNA（scramble，与任何已知基因无同源性，作为对照），CCGUAUCGUAAGCAGUACU；抗细胞周期蛋白D1的位点错配（下划线序列）siRNA（simutcycD1，用于确认 sicycD1的特异性），GUUCAUUUGGAAUCCGCCC。按照试剂盒说明利用阳离子脂质体2000转染试剂将siRNA转染至细胞中。

1.7 构建细胞周期蛋白D1稳定过表达ARO细胞系

编码细胞周期蛋白D1的互补DNA（complementary DNA，cDNA）是利用PCR方法源于人脑cDNA 文库（Invitrogen，Carlsbad，CA），然后亚克隆至真核表达质粒pcDNA3。该构建物经DNA测序核实无误，按照试剂盒说明利用阳离子脂质体2000转染试剂转染至细胞中。对照细胞用pcDNA3-Flag转染。转染细胞用G418（800 mg/mL）培养基进行筛选培养，得到阳性克隆后，进一步扩增培养，利用细胞周期蛋白D1或Flag抗体通过免疫印迹分析鉴定相关阳性蛋白表达细胞。

2 结果

2.1 衣霉素作用ARO对TRAIL的敏感性的影响

结果发现即使大剂量TRAIL（2 mg/ml）作用48 h，ARO细胞凋亡率仅为12%（图1A），表明ARO细胞抵抗TRAIL的抗肿瘤作用。20 mg/ml的衣霉素单独用药，ARO细胞凋亡率为11.5%（图1B）。然而，5 mg/ml衣霉素预处理24 h后，明显增加TRAIL诱导的ARO细胞凋亡，浓度为2 mg/ml时，ARO细胞凋亡率可高达56.5%，与TRAIL组、衣霉素组相比具有统计学差异（P<0.01）（图 1C）。TRAIL、衣霉素单药及两者联合用药对HTori-3的生存均无明显影响，细胞凋亡率<5%（图1D）。

2.2 衣霉素对ARO细胞G1向S期的进展影响

流式细胞仪检测显示对照组中G0/G1期细胞比率为31%，而TRAIL单药组G0/G1期细胞比率为34%，两组间没有统计学差异（P>0.05）；衣霉素组与联合用药组中G0/G1期细胞比率分别为51%和58%，两组间亦没有统计学差异，但与对照组和TRAIL组相比具有统计学差异（P<0.01）。这提示衣霉素可明显增加G0/G1期细胞，诱导G1/S期细胞阻滞。

2.3 衣霉素对ARO细胞中细胞周期蛋白D1和磷酸化Rb蛋白表达的影响

结果显示衣霉素作用于甲状腺癌ARO细胞，减少细胞周期蛋白D1蛋白表达的水平。与细胞周期蛋白D1促进细胞周期从G1期向S期进展的功能相一致，衣霉素导致细胞周期蛋白D1减少后也引起磷酸化蛋白Rb的显著下调（图2）。

2.4 CyclinD1微小RNA干扰细胞对TRAIL敏感性的影响

sicycD1有效封闭了细胞周期蛋白D1的表达，与衣霉素处理结果相似；而对照组及抗细胞周期蛋白D1的位点错配，即simutcycD1组中cyclinD1的表达无明显变化（图3）。与对照组及simutcycD1组（约50%）相比，sicycD1及衣霉素组中的细胞生存率显著下降，可达20%左右。

2.5 细胞周期蛋白D1过表达对衣霉素增敏TRAIL作用的影响

我们首先建立了细胞周期蛋白D1稳定过表达ARO细胞系（图4A）。细胞周期蛋白D1过表达明显降低衣霉素的增敏作用（图4B）。

3 讨论

本研究检测TRAIL单独用药对ARO细胞的毒性作用，与先前报道相似［5］，ARO细胞显示了对TRAIL治疗的抵抗作用。TRAIL诱导甲状腺癌凋亡的效应各异和许多肿瘤本身或通过治疗而获得的对TRAIL诱导凋亡的抵抗，限制了TRAIL治疗肿瘤的疗效。衣霉素已被用于增敏前列腺癌的自发TRAIL抵抗和结肠癌获得性的TRAIL抵抗。先前报道［4］证实衣霉素通过上调CHOP及其随后的DR5表达而增敏前列腺癌的TRAIL效应，但我们先前用衣霉素处理的甲状腺癌ARO中未见到上调的DR5表达［6］。本研究结果证实衣霉素通过下调细胞周期蛋白D1表达而增敏了甲状腺癌细胞ARO对TRAIL的效应。

有报道证实衣霉素可阻断G1/S细胞周期进程［7，8］，这与本实验结果相一致，并且先前研究［9～11］提示能够阻滞细胞停留在细胞周期G1期的药物能够提高TRAIL诱导的细胞毒性。细胞周期蛋白D1是一种细胞周期调节因子，据报道［12］其通常过度表达于甲状腺癌，更常见于未分化甲状腺癌。细胞周期蛋白D1表达受抑使细胞停滞于G1期，不能进入细胞有丝分裂的S期，进而导致肿瘤细胞增殖受抑，细胞凋亡。本研究发现衣霉素处理癌细胞后出现细胞周期蛋白D1的表达下调。细胞周期蛋白D1表达下调在衣霉素增敏TRAIL诱导细胞凋亡中的重要作用，亦被我们通过沉默细胞周期蛋白D1可增敏TRAIL的凋亡效应的观察所证实；反之，强制细胞周期蛋白D1过表达可降低衣霉素介导的TRAIL增敏效应。因此，认为细胞周期蛋白D1可能是甲状腺癌TRAIL抵抗的关键调节者之一，衣霉素的TRAIL增敏效应可能至少部分源于通过衣霉素介导的细胞周期蛋白D1表达受抑。鉴于许多甲状腺癌中细胞周期蛋白D1均被扩增和过表达，因此这些肿瘤可能更适于衣霉素和TRAIL的联合治疗。

我们的研究显示衣霉素和TRAIL联合处理对甲状腺未分化癌ARO细胞产生显著的细胞毒作用，而对分化的甲状腺上皮细胞HTori-3无显著影响。因此，对于TRAIL抵抗的甲状腺癌，TRAIL联合亚毒性剂量的衣霉素治疗可能会成为潜在的有效策略，但尚需大规模的动物实验和临床前期试验的进一步证实。

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