肝素结合细胞因子Midkine与甲状腺乳头状癌肿瘤生物学特征和BRAF突变的关系

宝荣，王欣，王佾，关海霞

（1.重庆市第九人民医院 病理科，重庆 400700；2.中国医科大学 附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，沈阳 110001）

甲状腺癌是人类最常见的内分泌恶性肿瘤，组织学上可分为甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）、滤泡状癌 （follicular thyroid cancer，FTC）、髓样癌（medullar thyroid cancer，MTC）和未分化癌等，其中PTC占所有甲状腺癌的80%～85%。近年来，PTC已经成为发病率增加最快的恶性肿瘤之一［1］。寻找有助于诊断PTC和评估其预后的标志物对PTC临床治疗策略的制定至关重要。本研究拟通过探讨肝素结合细胞因子Midkine（MK）在PTC中的表达及其与肿瘤生物学特征的关系，研究MK表达与PTC中的重要基因突变——BRAF基因突变［2］的关系，为PTC临床诊治策略的制定提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选择2002年至2006年在菏泽市立医院行手术治疗的PTC病例100例（男17例，女83例，年龄16～66岁，平均年龄45岁）；甲状腺腺瘤病例30例（男9例，女21例，年龄25～65岁，平均年龄48岁），以及癌对侧正常甲状腺组织20例（男3例，女17例，年龄17～57岁，平均年龄43岁）。上述标本均经10%福尔马林浸泡固定，石蜡包埋，4 μm切片。对PTC病例，收集其肿瘤生物学特征资料，包括肿瘤的甲状腺外侵袭情况、淋巴结转移和肿瘤分期。肿瘤分期参照美国癌症联合委员会现行标准［3］。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化：免疫组化染色采用SP法。MK抗体购自美国Abcam公司，SP试剂和AEC显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。阳性对照采用已知的阳性对照片，阴性对照使用磷酸盐缓冲液代替一抗进行，所有对照均与研究标本在同一条件下进行染色。采用双盲法判定MK阳性表达，以肿瘤细胞膜、胞质出现淡红色至深红色颗粒为阳性。全部细胞均无显色为0分；弱阳性或散在中等强度阳性显色为1分；散在强阳性显色或大部分细胞中等强度阳性显色为2分；大部分细胞强阳性显色为3分。

1.2.2BRAF突变检测：石蜡组织切片经二甲苯处理、蛋白酶K消化后，用标准酚-氯仿提取术和乙醇沉淀法将DNA分离出来。应用聚合酶链反应对标本DNABRAF基因的第15外显子进行扩增，上游引物序列为［4］：5′TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3′，下游引物序列为：5′GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3′。扩增后的产物经过Big Dye循环反应后进行直接测序（ABI PRISM 3730基因测序仪，加拿大）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行数据分析。分类数据采用频率和百分数表示，连续变量应用±s表示。分类变量的假设检验应用χ2检验，连续变量的假设检验应用t检验。P值采用双侧检验，以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 MK在正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤及PTC中的表达

MK在正常甲状腺组织中不表达，在甲状腺腺瘤和PTC中表达的阳性率分别为6.7%和87%，差异有统计学意义（P<0.01）。MK仅在2例甲状腺腺瘤中有散在的细胞胞质呈弱阳性显色，而在绝大多数PTC中大部分细胞的胞质呈中等强度至强阳性显色（图1）。甲状腺腺瘤和PTC中MK表达染色评分均值分别为0.07和1.98，差异有统计学意义（P<0.01），见表 1。

表1 MK在正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤及PTC中的表达Tab.1 Expression ofMKin tumor-adjacent normaltissue，thyroid adenoma，and papillary thyroid cancer

2.2 MK表达与甲状腺乳头状癌肿瘤生物学特征的关系

MK在PTC中的表达水平与患者性别无关。在具有恶性程度较高的肿瘤生物学特征（甲状腺腺外侵袭、伴有淋巴结转移和肿瘤分期Ⅲ/Ⅳ期）的PTC中，MK表达的强阳性率和染色评分均有明显增高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 PTC中MK表达与BRAF突变的相关性

100例PTC标本中，T1799ABRAF突变率为63%（图2）。30例甲状腺腺瘤和20例正常甲状腺组织中，未检出BRAF基因突变。

如表2所示，携带T1799ABRAF突变的PTC病例和携带野生型BRAF基因的PTC病例中，MK表达的阳性率分别为94%（59/63）和76%（28/37），有统计学差异（P<0.05），MK的表达平均评分分别为2.22和1.62，有统计学差异（P<0.05）。

表2 MK与PTC肿瘤生物学特征的关系Tab.2 Relationship between MKexpression and clinicopathologicalcharacteristics ofpapillary thyroid cancer

3 讨论

1988 年，Kadomatsu 等［5，6］发现了一个新的肝素结合生长因子MK。人MK基因定位于11p11.2，该基因上游有视黄酸应答因子的位点NF-κB结合位点及固醇类/甲状腺激素受体结合位点。MK的功能首先被定位于神经细胞的发育及分化，随后人们发现它也是一种多功能的生长因子［7，8］。在恶性肿瘤的发生发展中，往往有许多生长因子及其下游的信号传导系统参与其中［9］。MK作为一种生长因子，正常情况下在成年人各组织器官中不表达或表达水平很低，但在许多肿瘤组织中却发现了MK的高表达。1993 年，Tsutsui等［10］发现在 Wilm′s肿瘤、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌及食管癌的癌组织中MK的表达较癌旁组织均有不同程度的增高。1996年，O′Brien等［11］发现98%的肿瘤和70%的正常组织中表达MKmRNA，但前者的表达中值比后者高4倍。Nakanishi等［12］和 Miyashiro等［13］也报道了卵巢癌和乳腺癌中有MK高表达。但是，有关MK在甲状腺癌中表达的研究很少。

PTC是最常见的甲状腺癌类型，尽管其临床进展相对缓慢，但是仍有相当比例的患者因甲状腺腺外侵袭、淋巴结转移等影响了生活质量和疾病预后。因此，研究者们一直在寻找有助于确定PTC诊断和评估患者预后的指标。近年来的研究确定了PTC发生发展中的重要分子事件——BRAF基因突变。这一突变能引起BRAF蛋白第600位密码子的缬氨酸转变为谷氨酸，进而导致BRAF激酶和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路的持续活化［2］。转基因鼠的实验已经证实了BRAF突变的致PTC作用［14］。对多个临床研究的荟萃分析提示此突变与PTC的预后较差有关［2］。

本研究应用免疫组化方法检测了PTC中MK的表达，分析其表达的特异性及其与肿瘤生物学特征的相关性；同时还检测了PTC中BRAF基因突变的情况，探讨了MK表达与这一提示不良预后的突变之间的关系。结果显示，MK在正常甲状腺组织中不表达，在个别良性甲状腺腺瘤中仅有散在弱阳性表达，而在PTC组织中，无论是表达阳性率和染色强度均明显增加。这一结果与Kato等［15］的研究结果相似。本研究还发现MK的表达与PTC的肿瘤生物学特征相关。在恶性程度较高，如伴有腺外侵袭、淋巴结转移和肿瘤分期Ⅲ/Ⅳ期的肿瘤组织中，MK的表达明显高于恶性程度较低的病例。此外，MK的表达强度与BRAF突变也明确相关，发生突变的病例MK表达显著增加。MK在PTC中表达的特异性较高，并且与较高的肿瘤恶性特征相关，提示MK在PTC的发生发展过程中可能起重要的作用。另外，与BRAF突变相比，MK在PTC中表达的阳性率更高，而且免疫组化方法比基因测序在临床上实用性更强，因此MK作为临床协助诊断PTC和评估PTC预后的指标之一，具有更好的应用前景。

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