促红细胞生成素对离体幼兔缺血再灌注心肌中PI3K-Akt信号通路的影响

王文生，马洪亮，高洋

（中国医科大学 附属盛京医院心脏外科，沈阳 110004）

心肌缺血再灌注损伤虽然是临床实践中常见的组织器官损伤，但其准确机制仍不十分清楚。研究表明多种生长因子对心脏有保护作用，使其免受局部缺血及其再灌注损伤带来的损害。虽然这些心肌保护因子的转导通路很复杂，但在很多情况下，抗细胞凋亡是它们的一个共同特征［1］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）-蛋白激酶 B（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog，AKT）信号转导途径是细胞内重要的信号转导通路，在细胞的凋亡、存活、增殖以及细胞骨架的变化等活动中发挥重要的生物学功能，其中尤为重要的是它对细胞凋亡、存活的调节作用［2］。近年来，对缺血/再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤机制的研究日益深入，对未成熟心肌保护的认识进一步加深，提出了一些新的保护策略。其中，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的心肌保护作用引起了人们的关注［3］。本研究在初步观察EPO预处理可明显减轻心肌缺血再灌注损伤、对未成熟心肌具有一定的心肌保护作用及用量以EPO 5 000 U/kg效果最显著的基础上［4］，采用免疫组化和TUNNEL等方法进一步探讨EPO对未成熟心肌缺血再灌注损伤保护作用与PI3K-AKT信号转导途径的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

出生14～21 d的日本长耳大白兔30只（中国医科大学附属盛京医院动物室提供），体质量230～300 g，雌雄不拘。30只日本大耳白幼兔随机数字表法分为对照组与EPO预处理组，每组15只。在模型建立前24 h，EPO预处理组经腹腔注射EPO（5 000 U/kg，沈阳三生药业有限公司生产），对照组经腹腔注射同体积的生理盐水。

1.2 动物模型的建立

实验动物腹腔注射10%乌拉坦（10 ml/kg）麻醉，腹腔注射肝素钠（500 U/kg）抗凝。迅速取出心脏，经主动脉插管后，连接于灌注装置上，建立Langendorff幼兔离体心脏灌注模型。主动脉根部灌注37℃、95%O2+5%CO2混合气持续氧合的K-H缓冲液，压力7.98 kPa。经15 min的自然灌流平衡后，实验组及对照组分别用4℃心脏停搏液进行停搏。停搏30 min后，以37℃K-H液再灌注120 min。取再灌注120 min的左室心肌进行相关检测。

1.3 检测方法和观察指标

1.3.1 免疫组化法观察心肌组织PI3K、AKT及caspase 9表达情况：PI3K、AKT及caspase 9表达均为胞质染色，阳性者染成黄色或者棕黄色，阴性者不被染色，表达越强染色越深。应用Imagepro-Plus软件进行各个标本的平均光密度检测。

1.3.2 TUNNEL法检测细胞凋亡：凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致，而正常非凋亡细胞核被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致，在物镜（40×）下计算阳性细胞数和细胞总数，选择细胞总数200以上的视野，每个标本观察4张切片，取平均值，以心肌凋亡阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为心肌细胞凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，组间比较采用重复测量数据的方差分析，两两比较用多重比较t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K、AKT及caspase 9的心肌组织含量表达

心肌缺血再灌注120 min后，EPO组PI3K和AKT的心肌组织含量表达明显高于对照组（图1、图2），EPO组caspase 9的心肌组织含量则明显低于对照组（图3）。各免疫组化结果的平均灰密度值，EPO组与对照组之间差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 两组心肌缺血再灌注2 h后PI3K、AKT及caspase 9表达的比较（±s）Tab.1 Comparison of PI3K，AKT and caspase9 expression in ischemia-reperfusion myocardiac cells at 2 h after reperfusion（±s）

表1 两组心肌缺血再灌注2 h后PI3K、AKT及caspase 9表达的比较（±s）Tab.1 Comparison of PI3K，AKT and caspase9 expression in ischemia-reperfusion myocardiac cells at 2 h after reperfusion（±s）

1）P<0.01 vs control group.

Group n PI3K AKT Caspase-9 Control group 15 0.2687±0.0117 0.2384±0.0053 0.4334±0.0064 EPO-treated group 15 0.4138±0.00941） 0.4021±0.01361） 0.2449±0.01101）

2.2 心肌组织凋亡细胞的表达

心肌缺血再灌注120 min后，EPO组心肌组织凋亡细胞的数量明显低于对照组（图4）。心肌细胞凋亡指数 EPO 组（9.9±2.1）与对照组（15.9±1.5）比较存在统计学差异（P<0.01）。

3 讨论

研究结果［5］表明很多心肌缺血再灌注损伤保护方式都是通过激活了PI3K-Akt信号通路，从而抑制细胞凋亡，促进血管形成等作用而产生的。在PI3K家族中，IA型PI3K和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt（或PKB）所组成的信号通路因其调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等作用及与心肌保护发生发展的相关性，近年来备受瞩目。Kennedy等［6］发现，在血清撤离后，即使活化的 Ras、Raf和Src也不能完全传递存活信号，相反，PI3K活性的抑制能促进凋亡，而活化的AKT则能阻断凋亡。很多研究者在离体心脏模型试验中发现［7，8］，在再灌注初期加入PI3K的抑制剂wortmannin可以抵消缺血后处理的心肌保护作用。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase 9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等。Akt的激活不仅降低在体缺血再灌注模型中心肌细胞的死亡率，而且能真正地改善心肌局部和整体的功能。对细胞收缩和钙转运的测量说明心肌细胞Akt的激活在体外能保护心肌细胞免受缺氧诱导的功能障碍。Caspase是细胞凋亡的启动者和效应器，AKT能够磷酸化caspase 9使之失去其蛋白水解酶的活性，并进一步抑制 caspase 9 下游分子包括 caspase 2，3，6，8，10引起的一系列的串联反应进而抗细胞凋亡［9］。

EPO是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，主要是由肾皮质和髓质交界处的球旁细胞合成，分子量为30.4 kDa，其主要作用为促红系祖细胞分化及分裂为成熟红细胞，已广泛用于治疗肾衰竭，化疗及外科手术等多种原因所造成的贫血。研究证实EPO受体（erythropoietin receptor，EPOR）广泛分布于心血管系统，因此EPO在心血管系统中有着造血以外的多种生物作用［10］，近年来随着研究的深入，其心肌保护作用逐渐受到关注。研究表明［10］EPO预处理在心肌缺血再灌注损伤中具有显著的抗凋亡效应；这一效应与其上调抗凋亡基因bcl-2的表达有关，而bcl-2是第一个被直接证实的PI3-K-Akt/PKB信号转导途径下游调节细胞凋亡及存活的靶基因，故EPO预处理在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用可能与PI3K-AKT信号转导途径的抗凋亡作用有关。

本次研究再次选用幼兔离体心脏缺血再灌注模型，排除了在体心脏受神经、体液等多种因素的影响，从而观察药物对心脏的作用。实验结果显示：给予EPO预处理，可显著提高缺血再灌注120 min后的心肌组织PI3K及AKT表达，并显著降低缺血再灌注120 min后心肌组织caspase 9的表达。表明EPO预处理可能通过激活PI3K/AKT通路，激活PI3K，活化AKT的表达，进而抑制凋亡相关基因caspase 9的表达，减少心肌细胞凋亡，从而对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。另外，本实验与对照组相比，EPO预处理组缺血再灌注120 min后的心肌凋亡细胞明显较少，进一步证实了EPO预处理可能是通过抗细胞凋亡来起到对缺血再灌注心肌的保护作用的。

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