奥沙利铂通过抑制PI3K/Akt增强胃癌对TRAIL的敏感性

徐玲，曲秀娟，刘云鹏，刘静，张晔，侯科佐

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤内科，沈阳 110001）

胃癌是世界范围内最常发生的恶性肿瘤之一，多数患者在诊断时已经是晚期，5年生存率只有10%～15%［1］。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是肿瘤坏死因子家族的成员之一。在体外研究中，TRAIL诱导许多肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞毒性很小。但胃癌细胞对TRAIL不敏感［2］。TRAIL 与死亡受体 4（DR4）和死亡受体 5（DR5）结合后使受体三聚化，接着募集其他效应分子形成死亡诱导信号复合体（DISC），随后caspase活化，诱导凋亡发生。奥沙利铂作为第三代含铂药物，在胃癌治疗中已经取得一定疗效［3］。为提高胃癌对TRAIL的敏感性，本研究将奥沙利铂和TRAIL联合作用胃癌BGC823细胞，探讨联合用药的机制，以及对PI3K/Akt通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

重组人TRAIL购于美国Cytolab/Peprotech Asia公司。奥沙利铂购自Sanofi-Aventis公司。RPMI1640培养基购于Gibco公司。胎牛血清购于天津血液病研究所。RNase A购于AMRESCO公司。碘化丙啶（PI）、甲基偶氮唑蓝（MTT）和 LY294002购于Sigma-Aldrich公司。抗p-Akt，Akt及actin抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：人胃癌细胞株BGC823常规传代培养，生长于含有10%灭活胎牛血清，青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 mg/ml）的 RPMI 1640 培养基中，于37°C 5%CO2，饱和湿度的培养箱内培养。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡：取对数生长期细胞接种于96孔板，培养12 h后分别加入既定浓度的处理因素。16 h后分别收集对照组及处理组细胞，70%乙醇固定 4 h 后，加入 10 μl的 PI（20 μg/ml），避光孵育15 min，用FACScan流式细胞仪进行检测，WinMDI软件进行分析。

1.2.3 Western blot检测蛋白变化：收集细胞，冷PBS洗2次后加入1%Triton裂解液［1%Triton X-100，50 mmol/L Tris-Cl （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，2 μg/ml aprotinin］，冰上裂解 30 min，之后高速离心（15 000 r/m）30 min，取上清，Lowry法进行蛋白定量。将样品与3×样品缓冲液混合后，煮沸5 min，于10%的SDS-聚丙烯凝胶中电泳，之后电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗 p-Akt，Akt及 actin 4°C孵育过夜。TBST［10 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20］洗4次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育30 min，TBST洗后，ECL法显色，GIS凝胶图像分析系统成像并分析处理。

1.3 统计学分析

所有数据均为3次独立实验结果，以±s表示。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。2组间差异采用t检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 TRAIL作用BGC823细胞，只引起轻度的细胞凋亡，流式细胞仪分析显示，10，100，1000 ng/ml的TRAIL作用BGC823细胞16 h，细胞凋亡率不超过12%（图1）。结果表明，胃癌BGC823细胞对TRAIL耐药。

2.2 TRAIL作用BGC823细胞后，使PI3K/Akt活化

Western blot结果显示，100 ng/ml的TRAIL作用 BGC823 细胞 1 h，8 h，16 h，p-Akt的活化逐渐增强（图 2A）。PI3K 抑制剂 LY294002（25 μmol/L）预处理细胞1 h后再予TRAIL作用16 h，p-Akt被抑制至基线水平（图2B），同时细胞凋亡比率明显升高［（12.7±3.1）% 和（3.5±1.1）%，P<0.05］（图 2C）。结果提示，PI3K/Akt通路活化是胃癌BGC823细胞对TRAIL耐药的原因之一。

2.3 奥沙利铂增强TRAIL诱导的BGC823细胞凋亡

奥沙利铂（38 μg/ml）作用 BGC823 细胞 16 h，明显抑制了p-Akt的水平。奥沙利铂（38 μg/ml）联合TRAIL（100 ng/ml）作用 16 h，同样抑制了 p-Akt的水平（图 3A）。奥沙利铂（38 μg/ml）作用 BGC823细胞16 h，细胞凋亡率为 15.8±3.2%。 奥沙利铂（38 μg/ml）联合 TRAIL（100 ng/ml）作用 16 h，凋亡比率提高到（35.5±4.5）%（图3B）。联合组和单药组相比有统计学差异，P<0.05。结果表明，奥沙利铂通过抑制Akt的活化提高胃癌BGC823细胞对TRAIL的敏感性。

3 讨论

TRAIL作为能杀伤肿瘤的细胞因子，在肿瘤的治疗中有很好的应用前景，但胃癌细胞对TRAIL不敏感。有报告显示，当SGC7901细胞用300 ng/ml的TRAIL处理24 h只引起了11.8%的细胞凋亡［4］。在我们的研究中，当BGC823细胞用1 000 ng/ml的TRAIL处理16 h，细胞凋亡不超过12%。我们的结果显示，胃癌BGC823细胞对TRAIL耐药。

PI3K/Akt的主要作用是促进细胞增殖和阻止细胞凋亡［5，6］。在许多肿瘤中，Akt信号通路存在活化，这也是克服肿瘤对药物耐药的关键靶点［7］。有研究报告［8］，PI3K/Akt的高度活化是TRAIL耐药的原因之一。Chen等［9］报告在肝癌细胞中，TRAIL可诱导Akt磷酸化，进一步增加肝癌细胞对TRAIL的耐药性。在我们的研究中，TRAIL作用BGC823细胞后，诱导Akt的磷酸化。而LY294002，PI3K特异的抑制剂，能抑制Akt的活化，并提高胃癌对TRAIL的敏感性。提示Akt通路的活化可能是胃癌细胞对TRAIL耐药的原因之一。

目前的研究发现，顺铂，紫杉醇和表柔比星等药物能够增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性［10～12］。有研究报告，奥沙利铂能够抑制结肠癌细胞Akt的磷酸化［13，14］，提示Akt可能是奥沙利铂的作用靶点之一。我们的研究发现，在胃癌细胞中，奥沙利铂可以有效阻断TRAIL诱导的Akt磷酸化，并增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性。提示奥沙利铂逆转胃癌细胞对TRAIL的耐药可能是通过抑制了TRAIL诱导的PI3K/Akt生存通路活化。

综上所述，我们的研究证实了在胃癌细胞中，奥沙利铂可增强细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，其增效作用可能是通过抑制了TRAIL引起的PI3K/Akt活化，从而抑制生存通路。我们的结果表明，化疗药与TRAIL的联合很可能成为今后胃癌治疗的策略。

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