血红蛋白H病的高效液相色谱与血液学特点分析

张 力,区小冰,颜慕霞

(广州市妇女儿童医疗中心儿童院区血液室,广东广州 510120)

血红蛋白H病的高效液相色谱与血液学特点分析

张 力*,区小冰,颜慕霞

(广州市妇女儿童医疗中心儿童院区血液室,广东广州 510120)

目的分析血红蛋白H病(HbH病)在高效液相色谱及临床血液学表现的特点并探讨其原因。方法运用高效液相色谱技术(HPLC)对广东地区49例缺失型或血红蛋白Constant Spring(HbCS)复合HbH病进行诊断,详细记录其临床资料并测定其相关的血液学指标。结果①缺失型HbH病患儿可见一HbH峰,HbCS复合HbH病患儿既可见-HbH峰,又可见-HbCS峰。49例HbH病患儿中,缺失型HbH病38例(77.7%),HbCS复合HbH病11例(22.3%);②与缺失型HbH病患儿相比,HbCS复合HbH病患儿有明显的脾肿大,发育障碍及严重的贫血,其平均红细胞体积(MCV)增大,HbH包涵体含量增高。结论①HbH病以缺失型为主,HbCS复合HbH病在HPLC中可出现特异的HbCS峰。②高HbH包涵体含量以及α CS链在红细胞膜上的聚集是造成HbCS复合HbH病患儿临床表现比缺失型HbH病患儿严重的原因。

血红蛋白H病;高效液相色谱技术;临床表现

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1417)

血红蛋白H病(HbH病)属于α地中海贫血(α地贫),其产生的分子基础是由于4个α基因中有3个缺失或缺陷。α链合成严重不足,相对过剩的β链自行聚合为4聚体即血红蛋白H(HbH),HbH的性质不稳定,易形成包涵体,沉积于红细胞内,使红细胞的变形性和通透性发生改变,红细胞在通过脾脏时易于被破坏,出现贫血等临床症状。

HbH病可分为缺失型与非缺失型两大类,缺失型HbH病在外周血中可检出HbH。非缺失型HbH病在我国主要为血红蛋白Constant Spring(HbCS)和血红蛋白Quong Sze(HbQS)复合HbH病[1]。其外周血中除了有HbH外,还有HbCS或HbQS。HbCS属于不稳定血红蛋白,易于降解,在一般的血红蛋白电泳实验中不易检出。用分子生物学的方法可以准确诊断HbCS复合HbH病,但是分子生物学的方法操作较为复杂,对技术人员要求高,整个操作过程不易质控与标准化,不适于在广大临床实验室广泛开展。我们用高效液相色谱的方法检测HbH病患儿,并对他们的临床表现及血液学参数进行了研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2007年10月-2008年10月我院住院或门诊贫血的患儿49例,男31例,女18例,年龄2-13岁,均为广东籍,汉族,其间无亲缘关系,按张之南《血液病诊断和疗效标准》第二版[2],经分子生物学诊断为HbH病。

1.2 方法

1.2.1 常规血液学检查 用全自动血细胞分析系统(Cell Dyn 1700,美国COULTER公司。)检测红细胞计数(RBC),血红蛋白(Hb),红细胞平均体积(MCV),红细胞平均血红蛋白(MCH),红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)等红细胞参数的测定。HbH包涵体测定按《全国临床检验操作规程》[3]进行。

1.2.2 Hb高效液相色谱(HPLC)分析 取EDTA抗凝血2 ml(BD抗凝管)无须制备溶血液直接上高效液相色谱仪(VARIANT Ⅱ,美国 Bio-Rad公司。)分析。按仪器说明书操作,血红蛋白各成份定量约7分钟后由HPLC分析仪自动分析计算。

1.2.3 3种缺失型α地贫基因(--SEA,-α4.2,-α3.7)分析 采用跨越断裂点聚合酶链反应(Gap-PCR)方法进行,具体步骤见文献[4]。

1.2.4 2种非缺失型α地贫基因(HbCS,HbQS)分析采用反向点杂交方法进行,具体步骤见文献[5]。

2 结果

图1 HbH病患儿HPLC图谱

2.2 HbCS复合HbH病患儿的临床表现较缺失型HbH病患儿严重,其患儿脾脏肿大,依赖输血的比例均高于缺失型HbH病患儿,结果见表1。

2.3 缺失型与非缺失型HbH病患儿均表现出小细胞低色素性贫血,但程度有所差异。HbCS复合HbH病患儿的贫血程度,MCV,以及HbH包涵体的水平均高于缺失型HbH病患儿。结果见表2。

表1 缺失型与非缺失型HbH病患儿临床表现的比较

表2 两组患儿血液学参数的比较(±s)

表2 两组患儿血液学参数的比较(±s)

注:与缺失型HbH病比较:1)P＜0.05,2)P＜0.01

血液学检查 缺失型HbH病 HbCS复合HbH病RBC(×1012/L) 4.77±0.71 3.47±1.071)Hb(g/L) 98.0±11.0 71.0±9.02)MCV(fl) 67.1±7.1 77.7±5.72)MCH(pg) 19.9±1.4 20.2±1.8 MCHC(g/L) 296.6±19.3 260.0±13.72)HbH包涵体(%) 20.2±4.7 70.3±7.11)

3 讨论

HbH病的分子遗传学机制有异质性,其分子缺陷的背景十分复杂,具有种族和地域差异[6]。本文对49例HbH病患儿的检测表明,HbH病以缺失型为主(77.7%),非缺失型HbH病主要为HbCS复合HbH病,占HbH病的一小部分(22.3%)。

本研究的临床资料HbCS复合HbH病患儿的临床表现要比缺失型HbH患儿严重。血液学指标亦支持这一观点:此类患儿的Hb含量低于缺失型HbH病患儿,红细胞MCV增大,红细胞内HbH包涵体含量远高于缺失型HbH病患儿。近来有研究HbH包涵体是引起组织缺氧的原因,其含量与红细胞计数呈负相关[7]。与此同时,HbCS复合HbH病患儿同缺失型HbH病患儿相比,除了有高水平的HbH包涵体含量外,还有多余的α CS链。α CS链在红细胞膜上的聚集可损害红细胞膜上的Na-K联合转运通道,其氧化产物还会与红细胞膜上的骨架蛋白发生作用,造成红细胞膜的水化改变,破坏红细胞膜对红细胞MCV的调节作用,使红细胞MCV增大,进而使红细胞膜的脆性增大,变形能力变差,在通过脾窦毛细血管时易于被破坏而造成溶血[8]。我们认为正是这两个原因,造成了HbCS复合HbH病患儿的临床表现比缺失型HbH病患儿严重。临床上正确区分HbH病类型对指导HbH病的治疗与预后判断非常重要。

分子生物学方法是检测HbH病的金标准,虽然准确,但对实验室条件要求高,对技术要求严格,实验过程较复杂,不易进行质控,广泛用于临床检测有一定的困难,国内大多数临床医院对HbH病的诊断多依靠电泳的方法。

由于HbCS属于不稳定血红蛋白,易于降解,应用血红蛋白电泳的方法经常有漏诊。HPLC是以物理化学原理为主的分离分析方法,分离率高,可把理化性质相差很小的混合物通过分离技术,使微小差异的各组分分离。在分离的同时,根据出峰位置可以定性,根据峰面积可以定量。灵敏度高,选择性高,特别适用于生物大分子如各种血红蛋白组分的分离,对HbH病及HbCS复合HbH病诊断的敏感性要远高于电泳的方法[9]。且所需标本量少,标本无需前处理,操作简单,能最大限度地消除人为误差,数分钟即可出结果,满足了临床上对缺失型HbH病与HbCS复合HbH病快速诊断的要求。

[1]赵永忠,徐湘民,杨 阳.应用温度梯度凝胶电泳分析非缺失型α地中海贫血突变[J].中华医学遗传学杂志,2001,18:51.

[2]张之南,沈悌主编.血液病诊断及疗效标准[M].科学出版社,第三版,2007,29-35.

[3]叶应妩,王毓三,申子瑜主编.全国临床检验操作规程[M].东南大学出版社,第3版,2006,186.

[4]周玉球,肖鸽飞,梁 雄,等.中国人3种常见缺失型α-地中海贫血的快速检测及产前诊断[J].中国生育健康杂志,2003,14:30.

[5]Chan V,Yam I,Chen FE,Chan TK.A reverse dot-blot method for rapid detection of non-deletion alpha thalassemia[J].Br J Haemotol,1999,104:513.

[6]周玉球,肖奇志,黄丽娟,肖鸽飞,李文典,朱兰芳等.HbH病患儿临床表现与基因相关性的研究[J].中华儿科杂志,2004,42:693.

[7]Kanavakis E,Papassotiriou I,Karagiorga M,Vrettou C,Metaxotou-Mavrommati A,Stamoulakatou A,et al.Phenotypic andmolecular diversity of haemoglobin H disease:A Greek experience[J].Br J Haematol,2000,111:915.

[8]Pensri P,Pornpan S,Surai H,Wana M,Rawiprapa k,Anong P,et al.A correlation of erythrokinetics,ineffective erythropoiesis,and erythroid precursor apoptosis in Thai patients with thalassemia[J].Blood,2000,96:2606.

[9]Alla Joutovsky,Joan Hadzi-Nastic,Michael A.HPLC retention time as a diagnostic tool for hemoglobin variants and hemoglobinopathies:A study of 60000 samples in a clinical diagnostic laboratory[J].Clinical Chemistry,2004,50:1736.

The automated chromatography and clinical hematology analysis of hemoglobin H disease

ZHANG Li,OU Xiao-bing,YAN Mu-xia.(Department of Hematology,GuangZhou Children's Hospital,Guangzhou510120,China)

ObjectiveHemoglobin H disease(HbH)is the most severe type among survivors of αthalassemia.The aim of this study is to analyze the characterization of HbH disease in Gign performance liquid chromatography(HPLC)and clinical hematology and investigate the causes.MethodsForty-nine children with HbH disease or hemoglobin Constant Spring(HbCS)combined with HbH disease(HbH/CS)in GuangDong province were examined by using HPLC technique.All detailed clinical data of the caseswere recorded and all hematological findingswere evaluated.Results①In the HbH disease child,a HbH peak was present in the chromatogram and in the HbH/CS disease child,a HbH and a HbCS peak were present inthe chromatogram.Of these forty(nine children,thirty(eight(77.7%)were detected to be HbH disease and eleven(22.3%)were detected to be HbH/CS disease.②Comparedwith HbH disease children,HbH/CS disease children hadmarked spleen enlargement,thalassemic bone changes and severe anemia.Conclusion①Deletional type HbH disease was prevalent in these cases.HbH/CS disease demonstrated a characteristic HbCS peak in HPLC.②More severe clinical manifestation of HbH/CS disease children were related to significant higher HbH inclusion levels and the accumulation of α CS chains on the red blood cell membrane.

Hemoglobin H disease;High performance liquid chromatography;clinical manifestation

R331.1

A

1007-4287(2010)09-1417-03

广州市卫生局科研基金(30307-2080050)

*通讯作者

2010-02-19)