牛分枝杆菌溶血磷脂酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

徐广贤，周 晶，李 娟，贾 浩，王玉炯*

(1.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021；2.宁夏医科大学检验学院，宁夏银川750004)

牛结核病是一种人兽共患传染病，可通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而传染人[1]。牛分枝杆菌(Mycobaeterium bovis)是引起牛结核病的病原体，其宿主广泛，可感染多种家畜和野生动物，对人类和动物的健康构成危害[2]。

研究表明，M.bovis的一些磷脂代谢途径，与其致病性有关[3-4]。溶血磷脂酶(Lysophospho lipase，LIP)主要催化溶血磷脂水解为磷酸甘油和溶血磷脂酸，是催化其失活的主要途径，被认为在调节生物活性脂质水平中起关键作用[5]。溶血磷脂是磷脂代谢的中间产物，通常呈低水平广泛分布于各种生物的细胞膜上，具有除垢剂样特性和溶膜特征，是一种很强的生物活性因子[6]。

为了研究LIP基因在M.bovis致病机理中的作用，本研究对M.bovis的LIP基因进行克隆、原核表达，为进一步研究其LIP的功能及其生物学效应奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料M.bovis菌C 68-2株由中国兽医药品监察所提供；表达载体pET30a及DH5α和BL21菌株由本实验室保存。

1.2 目的基因的克隆与重组质粒的构建 根据GenBank中登录的M.bovis的LIP基因核苷酸序列，用primer 5.0软件设计引物，并由上海Sagon公司合成。上游引物LIP-S：5'-ATATGGTACCGAGCAT GCCCGCCGCTACGAC-3'；下游引物LIP-AS：5'-GT ACGAGCTCCTACAACCGCTCGGTGAGCCAG-3'(下划线分别为KpnⅠ和SacⅠ酶切位点)。

采用CTAB方法提取M.bovis基因组DNA[7]，以其为模板，参照ExTaqPCR试剂盒(TaKaRa)对LIP基因进行PCR扩增。PCR反应总体积为50 μL。PCR程序：95℃ 3 min；95℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃1 min，30个循环；然后72℃ 10 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用EZ-10Spin Colunm DNA Gel Extraction试剂盒回收740 bp左右DNA片段，经SacⅠ和KpnⅠ双酶切后，与用经过同相双酶切的pET30a(+)连接过夜，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，并命名为pET30a-LIP，并对目的基因进行测序鉴定。

1.3 重组蛋白的诱导表达 将重组菌37℃培养至OD600nm约0.8时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，于37℃诱导6 h。分别于诱导前和诱导后取出1 mL细菌培养物，离心，收集沉淀菌体，裂解后进行SDS-PAGE分析。

1.4 Western blot分析 SDS-PAGE电泳后，通过电转印系统将凝胶中的蛋白转到硝酸纤维素膜上，经脱脂牛奶封闭，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体，用DAB显色。兔抗一抗为M.bovis多克隆抗体进行免疫反应检测。

1.5 重组蛋白的纯化 超声波破碎菌体，沉淀经过包涵体洗涤液洗涤后，用含8 mol/L尿素的包涵体溶解液溶解。上清经梯度透析复性后进行SDSPAGE电泳，用预冷的0.25 mol/L KCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带，切下目的条带放入透析袋内，洗脱目的蛋白，取样进行SDS-PAGE电泳。

2 结果与讨论

2.1 重组蛋白的诱导表达与SDS-PAGE分析 经IPTG诱导的重组菌进行SDS-PAGE分析，结果在预期的30 ku处出现特异的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白的20%。对照空载体质粒没有特异表达条带(图 1)。

2.2 重组蛋白的western blot分析 Western blot结果显示，重组菌株在30 ku处出现目的条带(图2)，由此证明，该特异性蛋白条带为M.bovis的LIP重组蛋白，同时可与兔抗M.bovis多克隆抗体结合，表明LIP具免疫反应性(图2)。

2.3 重组蛋白的纯化 超声波破碎后的菌体，经过SDS-PAGE检查，结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。重组蛋白经过电洗脱回收，对纯化蛋白进行薄层扫描分析，表明蛋白的纯度可达95%以上(图 3)。

LIP是催化溶血磷脂失活的主要途径，在控制体内溶血磷脂的水平以保持正常的生物学功能方面起着重要作用。本研究克隆并构建了M.bovis的LIP原核表达重组质粒，经过对表达条件如IPTG的含量、诱导温度和诱导时间等方面的优化，使得LIP获得高效表达。在蛋白质纯化方面，其纯化方法与亲和层析回收蛋白的方法相比具有时间短、效率高的特点，可少量用于制备目的蛋白。免疫印迹分析表明，原核表达的蛋白可与兔抗M.bovis多克隆抗体结合，并且具特异的免疫反应性，为进一步研究其生物学效应奠定了基础。

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