亚洲1型口蹄疫病毒L蛋白缺失株的构建及其生物学定性

薛 美，王海伟，于 力

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室，黑龙江哈尔滨150001)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物传染病。病毒基因组为单股正链RNA，全长约为8 500 nt，其ORF编码一个大的多聚蛋白，由前导蛋白(Lpro)，P1结构蛋白，P2和P3非结构蛋白组成。其中Lpro是病毒基因组翻译的第一个蛋白，又称前导蛋白，其编码区存在两个AUG起始密码子，分别编码 Labpro(大)和 Lbpro(小)[1]。Labpro与 Lbpro间隔84个核苷酸，第一个AUG的使用频率低，第2个AUG的使用频率高。Lpro有两个已知的功能：首先，它能从延伸的多聚蛋白的N端自身催化分离，这种活性使得衣壳前体蛋白P1的N端豆蔻酰化，从而完成病毒衣壳的正确组装。其次，它能剪切真核翻译起始因子eIF-4F的p220亚基(eIF-4G)，从而抑制帽依赖型的宿主细胞的蛋白合成[2]。小RNA病毒合成的RNA无帽化结构，因此L蛋白阻碍宿主细胞蛋白合成的功能不影响病毒的进一步翻译。

Lpro是重要的毒力决定因子，根据这一特点，Piccone等以A12病毒为骨架构建缺失Lpro编码区的感染性克隆，拯救的Lpro缺失病毒对牛和猪不致病，而且感染动物没有传染性，可望用作基因缺失弱毒疫苗[2-3]。国内邹兴启等构建了猪O型FMDV OZK/93株Lpro编码基因缺失的感染性克隆，并对其进行基因修饰，探讨其作为疫苗载体的可行性[4]。FMDV的Lpro编码基因在不同血清型之间是高度变异的[5]，对于Asia1型FMDV Lpro功能的研究尚未见报道。

本研究首次构建了缺失毒力因子Lpro的Asia 1型FMDV的感染性克隆，为深入研究FMDV Lpro的功能建立了实验基础。

1 材料和方法

1.1 感染性克隆重组质粒和细胞系 Asia1型FMDV全长感染性cDNA克隆(pAsi)由本实验室构建[6]；乳仓鼠肾细胞BHK-21由本研究室保存，培养液为含10%胎牛血清的DMEM。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR DNA聚合酶，各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司。T4 DNA连接酶购自NEB公司，体外转录采用Promega公司的Ribo-MAXTMLarge Scale RNA Production systems-T7试剂盒。转染试剂采用QIAGEN公司的Effenctene Transfection Reagent转染试剂盒，羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司。针对亚洲1型FMDV的单克隆抗体(MAb)3E11由本实验室制备。

1.3 引物设计与PCR扩增 根据本实验室已构建的Asia1型FMDV全长基因组的cDNA设计两对引物，引物序列为：655U：5'-ACCCGTGCAACTTGA AACTCC-3'； DL1160L： 5'-CCGGACTGGATTGCCC GGCTCCCATCTTTCCTTGTGTCCGTG-3'； 2143L：5'-CGGCGTCCAGTCAAACAGGTG-3'； DL1155U：5'-TCTTTCACGGACACAAGGAAAGATGGGAGCCG GGCA ATCCAGTC-3'。用融合PCR方法缺失自第二个启动子AUG之后的Lpro编码区。融合后片段全长为993 bp，PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 PCR产物纯化、克隆及测序 采用试剂盒并按操作手册对PCR扩增产物进行凝胶切割纯化，PCR胶回收产物与FMDV pAsi同时用Xba1和Nde1双酶切，将PCR扩增片段克隆于pAsi中，采用试剂盒提取重组质粒，酶切鉴定，由英峻生物技术公司测序。

1.5 体外转录和转染 重组质粒以EcoRV切酶线性化，并将其纯化，按RiboMAXTMLarge Scale RNA Production systems-T7试剂盒操作说明书的方法进行体外转录。将体外转录的RNA用QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent转染试剂转染80%单层的BHK-21细胞。转染后培养至细胞出现病变，将细胞培养物反复冻融3次，2 000 r/min离心10 min，取上清连续传代7次进行病毒扩增。

1.6 间接免疫荧光检测(IFA) 将转染后收获的细胞培养物上清接种96孔板上的BHK-21细胞，用预冷的无水乙醇固定20 min，漂洗后洗净残液，加入Asia1/YS/CHA/05 特异 性 MAb 3E11(1∶200)50 μL/孔，置湿盒中1 h，用PBS洗3次，滴加羊抗鼠FITC(1∶200)，置湿盒孵育50 min，PBS洗3次，于荧光倒置显微镜下观察，用Leica成像系统拍照记录。

1.7 一步生长曲线 在单层BHK-21细胞中，按5 TCID50/cell分别接种拯救病毒和亲本病毒，37℃吸附1 h后用PBS洗去未吸附的病毒，加2%FBS维持液培养，在2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h和14 h的时间点分别收获病毒，测定不同时间点收获病毒的TCID50，每个时间点重复3次。以病毒生长时间为横坐标、以病毒在不同时间点的TCID50平均值为纵坐标，绘制病毒的一步生长曲线，比较拯救病毒和亲本病毒在BHK-21细胞上的增殖特性和复制能力。

1.8 拯救病毒对乳鼠的毒力检测 选用3日龄乳鼠45只，其中40只随机分为A、B两组。分别颈部皮下注射稀释为0.01 TCID50、0.1 TCID50、1 TCID50、10 TCID50的病毒液200 μL，A组20只注射亲本毒，B组20只注射拯救病毒，阴性对照组只注射PBS(200 μL/只)，观察拯救病毒对乳鼠的致病性，并与亲本毒进行比较。

2 结 果

2.1 缺失 Lpro的 Asia1型 FMDV(rFMDV-ΔL)的拯救 用体外转录的RNA转染BHK-21细胞后72 h，细胞出现细胞病变(CPE)，表现为细胞变圆，呈葡萄串状分布，最后崩解成碎片。将细胞培养物连续传代，CPE出现的时间逐渐缩短，CPE更为典型，传至第3代时在接种病毒后10 h出现明显的CPE。

2.2 拯救病毒的RT-PCR鉴定 从拯救病毒中提取RNA，反转录，用655U，2143L两对引物进行PCR扩增，亲本病毒扩增出约1.5 kb片段，而拯救病毒扩增出约1 kb的片段(图1)。结果表明，拯救病毒的Lpro基因发生了516 bp的缺失，与预期结果一致。同时，PCR扩增产物胶回收后进行序列测定，验证了第二个起始密码子AUG之后的Lpro基因的缺失。

2.3 拯救病毒间接免疫荧光检测 以MAb 3E11作为检测抗体，利用IFA方法，对亲本病毒和拯救病毒感染的BHK-21细胞及正常BHK-21细胞进行免疫荧光检测，可见拯救病毒和亲本病毒感染的BHK-21细胞均有特异性免疫荧光产生(图2)，而正常细胞没有出现荧光反应，表明Lpro发生缺失的重组病毒被拯救。

2.4 拯救病毒的增殖特性 为研究Lpro缺失对病毒复制的影响，将拯救病毒和亲本病毒稀释成106TCID50，各取1 mL分别接种BHK-21细胞，吸附1 h后用PBS洗去未吸附的病毒。在接种后第2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h和 14 h分别收获病毒，用Karber法计算TCID50，绘制一步生长曲线，以比较拯救病毒和亲本病毒在BHK-21细胞上的增殖特性和复制能力。结果表明，Lpro缺失病毒与亲本病毒相比，在BHK-21细胞上的复制能力下降(下降约10倍)，并且病毒滴度达到峰值所需的时间明显延长(图3)，说明缺失了 Lpro的 Asia1型FMDV在 BHK-21细胞上的复制明显减慢。

2.5 拯救病毒对乳鼠的致病性 为研究Lpro对病毒致病力的影响，将拯救病毒在BHK-21细胞上连传7代后，接种3日龄乳鼠，以亲本毒株作为对照。结果亲本毒的LD50为10-8.2，而缺失Lpro病毒的LD50下降为10-7.4。这表明，缺失Lpro的Asia1型FMDV对乳鼠的毒力有所下降。并且亲本毒株死亡乳鼠出现症状十几小时内死亡，死亡时间均在接毒后48 h以内；而拯救病毒接种乳鼠72 h后部分乳鼠才表现呼吸困难，后肢瘫痪等症状，从出现症状到死亡的时间明显延长，最长可在出现症状后3 d死亡，说明病毒在乳鼠体内的复制也明显减慢。

3 讨 论

Lpro能够从病毒多聚蛋白的N端自我剪切下来，也能裂解真核翻译起始因子eIF4G，阻断宿主帽依赖性的 mRNA的翻译[6]。为探讨 Lpro在 Asia1型FMDV复制和毒力方面所起的作用，本研究在Asia1型FMDV反向遗传操作平台基础上，利用融合PCR方法缺失前导蛋白酶L基因编码区，构建了缺失Lpro的病毒感染性克隆，并拯救出病毒。对拯救病毒进行生物学定性发现，Lpro缺失病毒与亲本病毒相比在BHK-21细胞上的复制能力明显下降(下降10倍)，致BHK-21 CPE的速度明显变慢，在BHK-21细胞上形成蚀斑的时间延长。体内试验表明Lpro缺失病毒对乳鼠的毒力也有所下降(比亲本毒株下降6倍)，并且致乳鼠死亡的时间也比亲本毒株明显延长，说明病毒在乳鼠体内的增殖速度也明显变慢。

FMDV基因组的翻译是从相隔84个核苷酸的两个起始AUG开始的[7]，第二个AUG为形成完整的病毒粒子所必需，并且两个AUG之间的RNA序列对有效地起始翻译也是必需的[2,6]。因此我们构建感染性克隆时保留了第二个起始密码子AUG，构建了自第二个AUG开始缺失的感染性cDNA，将体外转录获得的RNA转染BHK-21细胞，拯救出了Lpro部分缺失的重组病毒。

Lpro通过自身切割从病毒多聚蛋白中游离，剪切点位于自身的羧基端和VP4氨基端的K201和G202之间[8]。Walter等的研究表明，将Lbpro201位K突变为Q或G均严重影响Lbpro的自我剪切功能，该位置的突变使得自我剪切下的Lbpro的比例从野生毒株的85.5%下降到37.5%[8]。这表明在易断裂键的一侧存在一个碱性残基，Lbpro才能进行高效的自身切割。本研究构建的感染性cDNA缺失了自第二个AUG之后的序列，使得Lpro与VP4之间的剪切位点由KLK↓GAG变为GKM↓GAG，M属于含硫氨基酸类，而不是碱性氨基酸，因此我们推测这使Lpro不能有效地从多聚蛋白上剪切下来。Lpro从延伸的多聚蛋白的N端自身催化分离的活性能够使衣壳前体蛋白P1的N端豆蔻酰化，从而完成病毒衣壳的正确组装，缺失了第二个AUG之后的缺损Lpro不能如同完整的Lpro那样高效地从延伸的多聚蛋白上自我剪切下来，影响了病毒的组装，因此Lpro缺失病毒与亲本病毒相比在BHK-21细胞上的复制能力明显下降。由于在同样的时间段内形成的病毒粒子较少，表现为致CPE作用比亲本毒株慢许多。

在体内，Lpro缺失病毒对乳鼠的毒力有所下降，这与病毒在BHK-21细胞上形成CPE的时间延长的现象相一致。完整病毒粒子Lpro的存在抑制了帽依赖性的宿主蛋白的翻译，病毒进而利用宿主细胞的合成机制进行生物合成。当病毒缺失Lpro时，宿主蛋白的翻译与病毒蛋白的翻译发生竞争，对病毒蛋白的合成产生影响，因此缺失Lpro的病毒复制能力下降，表现为对乳鼠的毒力降低[11]。

对Lpro进行研究，有助于对病毒复制的了解。另外，Lpro不仅能在自身羧基端和VP4的氨基端进行切割游离自己，从而完成病毒的正确组装，还能剪切宿主翻译起始因子eIF-4G，抑制宿主帽依赖性的mRNA的翻译，包括α/β IFN mRNA的翻译，阻止或降低细胞对病毒感染的先天性免疫反应[9]。因此，开发能够阻断L蛋白酶切活性的抑制剂，有可能为预防口蹄疫提供一种新的途径。

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