抗H5N1亚型高致病性禽流感猴源噬菌体scFv的构建和表达

陈 樱，邓国华，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001)

近年来，有关H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)在禽类中爆发及人群中流行的报道已经引起世界范围内的广泛关注。根据世界卫生组织公布的最新数据，至2009年7月1日，全球共发生人感染禽流感病例436例，死亡262例[1]，病死率为60%。紧接着发生甲型H1N1流感，肆虐全球，导致89 921人感染，382人死亡[2]，该型流感病毒虽然致死率不如H5N1亚型禽流感，但其传播速度快，范围广。目前除了支持疗法外，其他可供选择的有效治疗方法非常局限，而且存在一些H5N1亚型AIV对现有抗病毒药物具有耐药性，例如金刚烷胺和金刚乙胺，补充说明的是H5N1亚型病毒对奥塞米韦耐受已有报道[3-4]。除此之外，虽然疫苗对成年人产生保护率在70%～90%之间[5-6]，但是婴儿、儿童、老年人和免疫抑制者感染流感的机率却很高[7-8]，并且疫苗的研制必须根据当时流行毒株的亚型来制备，所花时间为6个月，甚至更长，这些不利因素给流感的预防和控制带来困难。治疗性抗体的研发对流感的预防和治疗有一定的辅助意义，本研究旨在构建抗H5N1亚型AIV的单链抗体(scFv)，并通过噬菌体展示技术，筛选出有活性的scFv，为嵌合抗体或人源化抗体的构建提供可用的可变区片段。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞株及菌株 AIV A/Duck/ZJ/11/00(H5N1)株由本实验室分离保存；抗H5N1亚型AIV猴源外周淋巴细胞由本实验室制备保存；E.coliJM109菌株由本实验室保存。

1.2 主要试剂 重组噬菌体抗体系统和Anti-E Tag纯化试剂盒购自Pharmacia公司。RNeasy Mini kit购自QIAGEN公司。小量胶回收试剂盒与小量质粒回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。DNA Marker DL2000、DL15000购自宝生物工程(大连)有限公司。鼠源反转录酶试剂盒、PFX聚合酶和RNase OUT均购自Invitrogen公司。

1.3 引物的设计和合成 根据抗体框架区的保守区域合成兼并引物和构建scFv引物[9]，由Introvigen公司合成。

1.4 猴源淋巴细胞可变区基因的扩增 提取猴的外周血淋巴细胞，按照RNeasy Mini kit的方法提取总RNA，并按照试剂盒说明进行第一链反转录合成得到cDNA。以其为模板采用VH和VL引物分别扩增出抗体重链和轻链可变区基因。反应体系50 μL；反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 s、53℃ 30 s、68℃1 min；共进行30个循环，68℃延伸10 min。

1.5 scFv的构建 在重链可变区基因VH的5'端引入酶切位点SfiⅠ，在3'端引入Linker的前部分序列；在轻链可变区基因Vλ和Vκ的5'端引入Linker的后部分序列，3'端引入酶切位点NotⅠ。PCR产物纯化后，再用Linker引物2次扩增得到VLL，最后用VH-res的上游引物和LV-res和KV-res的下游引物同时扩增，将VH与Vλ和Vκ连接，进行SOEPCR反应。反应条件为：94℃1 min；60℃1 min、72℃1 min，进行7个循环；然后94℃1 min、60℃1 min、72℃1 min；进行25个循环，最后72℃延伸10 min。

1.6 噬菌体scFv的表面展示

1.6.1 scFv库的构建 scFv基因分别以SfiⅠ和NotⅠ双酶切后，克隆于噬粒pCANTAB 5E，构建重组噬粒。以重组噬粒转化E.coliTG1感受态细胞，并加入辅助噬菌体M13KO7(4×1010cfu)，装配重组噬菌体，构建抗H5N1亚型AIV的scFv初级噬菌体库。用1∶200稀释的AIV包被酶标板，封闭后筛选。用PEG/NaCl沉淀噬菌体上清，冰浴1 h，4℃离心12 000 r/min，20 min，收集噬菌体沉淀。以含有1%BSA的PBS重悬沉淀，室温封闭15 min，分别加入包被好的酶标孔，37℃温育2 h，以PBS充分洗涤20次，用含0.1%土温20的PBS冲洗20次后，加入50 μL洗脱缓冲液洗脱结合的重组噬菌体，以3 μL Tris缓冲液中和；再感染对数生长期的E.coliTG1，重复3次上述“吸附-洗脱-扩增”的淘洗过程。

1.6.2 scFv阳性克隆的筛选与鉴定 将第3轮筛选得到的重组菌涂LB琼脂平皿，从中随机挑选96个菌落，进行诱导表达，取上清液，采用HRP标记的抗E-Tag单抗进行ELISA检测。

1.7 阳性克隆的序列测定 根据CEQTM DTCS Quick Start Kit对质粒进行测序，登录NCBI中的IgBLAST基因数据库对所测定的序列进行网上比较分析。

1.8 scFv的可溶性表达 将收集的重组噬菌体感染HB2151细菌，划线涂板，挑取单个菌落于2×YTAG培养基中，30℃，200 r/min培养过夜。将5 mL菌液接种到50 mL 2×YT-AG培养基，30℃培养1 h，OD600nm达到0.4～0.5之间，室温离心3 000 r/min，20 min；弃上清，用50 mL 2×YT-AI培养基重悬沉淀。30℃培养20 h，200 r/min。将菌液以同样转速离心，将沉淀的菌体做胞质提取，将上清浓缩，进行12%SDS-PAGE电泳和ELISA检测。

1.9 scFv表达产物的鉴定 将有目的条带出现的样品细胞周质腔蛋白提取物和上清进行12%SDS-PAGE电泳。电泳结束后，转移到硝酸纤维素膜。用1∶5 000稀释的鼠源Anti-E-Tag单克隆抗体(MAb)作为一抗，用1∶5 000稀释的红外荧光标记抗鼠抗体作为二抗，进行western blot鉴定。

1.10 scFv的纯化 阳性重组噬菌体感染大肠杆菌HB2151培养20 h后离心，取上清和细胞周质腔蛋白提取物，根据GE公司纯化试剂盒说明进行纯化，将纯化产物进行ELISA分析。

1.11 间接免疫荧光鉴定抗体活性 按100 TCID50病毒量接种细胞，以表达产物(scFv)为一抗，鼠源抗E-tag的MAb为二抗，再加入荧光标记抗鼠二抗。设不加scFv为阴性对照，用间接免疫荧光鉴定抗体活性。

1.12 竞争抑制ELISA 将AIV包被酶标板，以PBS为阴性对照。以稀释到10-2的猴源阳性血清标准，将纯化的scFv H6与该稀释度的猴源阳性血清混合加入酶标孔，37℃孵育1 h后前者加入抗兔抗猴的酶标抗体，OPD显色；测OD490nm值，并计算抑制率。公式为：抑制率(%)=100-(混合抗体的A值)/(猴源阳性血清的A值)。

2 结 果

2.1 scFV的VH、VL基因片段的扩增以及scFv的构建 以反转录cDNA为模板扩增出VH基因；以同样方式扩增出Vλ和Vκ基因。VH基因片段约为350 bp，Vλ和Vκ基因片段约为330 bp。以纯化的VH、Vλ和Vκ基因片段为模板，采用重叠延伸PCR扩增scFv基因与DNA分子量标准比较后，scFv基因片段约为750 bp，与理论计算值相符(图1)。

2.2 噬菌体抗体库的淘筛与鉴定 以H5N1亚型AIV作为固相化的抗原，对噬菌体单链可变区抗体库进行3轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选，特异性噬菌粒的富集结果见表1。结果表明，随着淘洗次数的增加，洗脱下来的噬菌粒数也随之增加，第3轮筛选后的产出率增加约6.3×104多倍，这表明携带有抗H5N1特异性抗体的噬菌体得到了高度富集。

表1 特异噬菌体富集结果Table 1 The assay of specific phages enrichment

2.3 scFv的鉴定 从第3轮淘选得到的噬菌体感染的E.coliTG1中，随机挑选96个克隆，超感染制备噬菌体抗体上清，用ELISA法检测上清中含有的抗H5N1亚型AIV的scFv与AIV抗原的结合活性，其中9株上清ELISA的吸光度OD490nm较高，分别用PBS和鸡抗H5N1亚型AIV多克隆血清作为阴性和阳性对照(图2)。表明这些噬菌体抗体具有特异性结合H5N1亚型病毒抗原的活性，其中，H6株的活性最高。

2.4 阳性克隆株DNA序列的测定 H6阳性克隆株是以VH和Vλ的组合方式，将阳性克隆H6株扩大培养，测序得到736 bp的scFv，编码245个氨基酸；重链可变区VH长为357 bp，编码119个氨基酸；轻链可变区Vλ长为334 bp，编码111个氨基酸。序列已录入GenBank(GU451044)。与IgBlast进行序列比对，VH与人源IGHV1同源性达75%，而Vλ与人源IGLV2的同源性相对较高，达到91.5%，通过IMGT/V-QUEST确定抗体互补决定区(表2)。

表2 抗H5N1亚型AIVscFv的互补决定区氨基酸序列Table 2 The amino acid sequence of scFv gene CDR against H5N1 influenza virus

2.5 Western blot免疫印迹法鉴定scFv 将筛选出的H6阳性克隆感染E.coliHB2151，经IPTG诱导表达后，取H6浓缩培养液上清及质周腔提取液，未转化HB2151培养上清各20 μL进行SDS-PAGE和western blot分析(图3)。结果发现浓缩的上清和胞质提取液有约32 ku明显的目的条带，并且上清表达量比质周腔提取液的相对少；而阴性对照没有类似的条带出现。表明成功获得了抗H5N1亚型噬菌体scFv表达菌株，在诱导表达后，细菌胞周质腔中含有相对丰富的目的scFv。

2.6 scFv的纯化 由于scFv蛋白的羧基末端带有E-tag，用抗E-tag抗体亲和层析对胞周质提取物进行分离纯化后，目的蛋白纯度进一步提高(图3)。SDS-PAGE和western blot分析发现在32 ku处出现单一条带，并且具有与抗E-Tag反应的特异性。

2.7 间接免疫荧光鉴定 将纯化的scFv与病毒相互作用，结果发现MDCK的细胞浆出现荧光阳性(图4A)，阴性对照未出现绿色荧光(图4B)。表明纯化所得的scFv能够与该病毒发生特异性结合。

2.8 竞争抑制ELISA检测scFv的抗原结合活性scFv与阳性猴血清混合反应的OD值随着scFv浓度的增加而逐步降低。当scFv稀释倍数达到1∶1时，抑制率最高为11.4%，这表明猴源噬菌体scFv与猴血清结合同一抗原表位，同时证明其与猴血清有相同的抗原结合特异性(表3)。

表3 scFv与猴血清竞争抑制ELISA结果Table 3 Inhibation assay of scFv withrhesus macaque serum by competition ELISA

3 讨 论

本研究根据Pelat等首次报道关于猴源scFv的研究方法[10]。采用免疫H5N1亚型AIV的猕猴外周血淋巴细胞的胚系基因作为治疗性抗体的供体基因，通用噬菌体计数以及噬菌体ELISA淘选，构建了猴源噬菌体scFv库，但是在淘选过程中，出现部分轻链丢失，这可能由于重组抗体的遗传不稳定性。同时，我们发现传统的洗脱方法更有利于噬菌体的收集，而商品化试剂盒中提供的不洗脱直接加入E.coliTG1的富集方法不利于噬菌体感染。从结果中分析，3轮筛选后，库容量逐渐增大，产出率增加约6.3×104多倍，利用固相筛选更利于特异性和高亲和力抗体的获得，这也是特异性抗体富集的体现。本实验筛选得出了7株scFv(G2、A4、E4、B5、E6、H6和B8)，它们针对AIV的活性有所不同，其中以H6株活性相对较高，测序发现该scFv的组合形式为VH-Linker-Vλ，而VH-Linker-Vκ形式的scFv在筛选中发现丢失。在可溶性表达中，也发现7株scFv并不是都能表达，并且有些表达量相当低，只有在纯化后才能看到明显条带。该可溶性表达依赖于非抑制性大肠杆菌HB2151，它可以识别scFv和gIIIp之间的琥珀终止码，因此蛋白质翻译过程能够在scFv末端终止，不会产生融合蛋白。由于载体PCANTAB 5E上的信号肽，表达的scFv抗体被转运至细菌周质腔中，随着诱导时间的延长，表达的蛋白在周质中积累过多而释放到培养基中，所以检测发现胞周质中蛋白比上清的含量高。间接免疫荧光检测证明,该scFv对H5N1亚型AIV具有特异结合能力，而竞争抑制ELISA则进一步证实其对病毒的结合能力，但在中和实验和血凝抑制实验(数据未出示)未取得较好效果。原因，可能由于外周血淋巴细胞中分泌特异性抗流感IgG抗体相对较少[11]，所以在庞大的噬菌体库中筛选到的几率就相对较低。本实验筛选得到的噬菌体scFv的H6株虽然与病毒有特异性结合能力，却不能阻断病毒的受体，所以推测该scFv所针对的病毒蛋白不是HA，有待进一步筛选。

本研究利用IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr)的软件分析该scFv(VH-Linker-Vλ)，确定了重链和轻链可变区中的互补决定区。通过IgBLAST比对发现所获得的猴源scFv的轻链基因与人免疫球蛋白胚系基因的同源性高达91.5%，而重链基因的同源性相对较低，只有75%，这可能是由于在灵长类的进化过程中，多重重组的发生使免疫球蛋白重链基因恒定区家族不断的发生重复和缺失，从而导致灵长类IGHC基因的数目变异相对人类的较大[12]。尽管如此，有研究表明，恒河猴与黑猩猩、人类有97.5%的基因组是相似的，而后两者基因组的相似度为99%[13-14]。因此，本实验所构建的猴源scFv为改造嵌合抗体或人源化抗体[15]提供了重要的可变区骨架，同时也为探索高致病性禽流感疾病的治疗开辟了新的途径。

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