结核杆菌多位点环介导等温扩增检测方法的建立

王正荣，陈创夫,*，杨明锋，孟 茹，曹旭东，张 辉，乔 军

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2.新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子832003)

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性疾病，能够感染人和多种哺乳动物以及禽类，其中导致人类感染的结核菌大多数是人结核分枝杆菌，也有10%以上是由牛分枝杆菌引起的[2]。结核分枝杆菌的培养周期较长，使用罗氏培养基进行细菌分离鉴定周期长达1～2个月[3]，不利于结核分枝杆菌的快速检测。20世纪90年代以来，分子生物学检测技术快速发展，各种新的基因检测技术不断出现[4-6]。由于目前基因检测技术的复杂性和结核分枝杆菌的高传染性，要进行结核分枝杆菌的基因检测，不仅需要昂贵的仪器设备，而且对实验室条件也有很高的要求[7]，这给结核病的快速诊断造成许多困难。环介导等温基因扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的DNA扩增方法[8]，具有简单、快速、特异性强的特点。为此,本实验采用LAMP法对痰样本中的结核分枝杆菌进行检测，并对该方法的灵敏性、特异性以及从痰样中区分致病性结核分枝杆菌和非致病性结核分枝杆菌，鉴别诊断结核分支杆菌和牛分枝杆菌的准确性做了评估。

1 材料和方法

1.1 菌株及主要仪器和试剂 结核分枝杆菌标准株H37Rv(Mycobacterium tuberculosis，H37Rv)、结核分枝杆菌弱毒株H37Ra(M.tuberculosis，H37Ra)、卡介苗BCG、龟分枝杆菌(M.chelonae)，均为本实验室保存，牛分枝杆菌(M.bovis，C68003)、牛分枝杆菌(M.bovis，C68014)、禽分枝杆菌(M.anvim，C68223)均购自中国兽医药品监察所。HW-8C型微量恒温器购自绍兴卫星医疗设备公司；BstDNA聚合酶购自NEB公司，SYRB-GREENⅠ购自北京鼎国生物技术有限责任公司；100 bp DNA Ladder购自AXCENGE公司，Taq酶购自天根生化科技有限公司；呼吸道样本DNA提取试剂盒购自Roche Diagnostics GmbH公司；限制性内切酶PstⅠ、SphⅠ、EcoRⅠ均购自TaKaRa公司。

1.2 引物设计 根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6(NP3849089)，结核分枝杆菌(NP 214519)和牛分枝杆菌(NP853675)gyrB共有特征性序列，以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40(NP69737)，使用Primer ExplorerⅣ软件设计6对特征性引物，引物由上海生工合成(表1)。

1.3 检测样品DNA的提取 采用口腔拭子DNA提取试剂盒提取60份来自60个结核病人的痰样基因组；同时，将痰样接种罗氏培养基进行培养。采用常规酚-氯仿抽提法提取各标准菌株基因组DNA。

1.4 LAMP检测方法的建立 25 μL LAMP反应体系：FIP和 BIP各 0.8 μmol/L，F3和 B3各0.2 μmol/L、1.6 mmol/L dNTPs、6.0 mmol/L MgSO4、1 M Betaine、10×BstDNA Polymerase Buffer 2.5 μL、BstDNA 聚合酶8 u，加ddH2O至25 μL，移至制备好的模板中混匀。反应条件：63.5℃反应50 min，85℃2 min终止反应。每管加入100×SYBR GreenⅠ1 μL，呈绿色为阳性，棕色为阴性；取5 μL扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，LAMP产物的电泳图呈特征性梯状条带。

表1 LAMP扩增所需引物和序列位置Table 1 The primer and the site of sequence for LAMP

1.5 LAMP扩增反应的特异性、敏感性和准确性的检测

1.5.1 LAMP扩增反应特异性、敏感性的检测 分别以人结核分枝杆菌标准株H37Rv、弱毒株H37Ra、卡介苗BCG、牛分支杆菌、龟分枝杆菌、禽分枝杆菌基因组为模板对建立的LAMP方法的特异性进行检测。以本实验室构建的esat-6重组质粒为模板，并对其进行稀释：100～1010，测出相应的OD值，换算各浓度稀释液中质粒的拷贝数，然后进行LAMP检测，确定该检测方法能检测到的最低浓度，进行3次重复试验。

1.5.2 临床样本符合率检测 从某医院传染科收集60份痰液样本(含非结核病患者痰液及结核病患者痰液，使用酸性罗氏培养法进行鉴定)，痰标本加入3倍～5倍体积分数为2%N-acety-L-cysteine-NaOH，振荡混匀孵育15 min，加入0.067 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)至总体积40 mL，以3 000 r/min离心15 min，弃上清液，留沉淀。使用呼吸道样本DNA提取试剂盒提取痰液中的DNA。DNA提取物分别用于PCR验证及LAMP法检测。同时将痰样接种酸性罗氏鉴别培养基。

1.6 LAMP扩增产物的酶切鉴定 实验选用PstⅠ、SphⅠ、EcoRⅠ3种限制性内切酶，分别对esat-6、gyrB、mtp40基因的LAMP扩增产物进行酶切鉴定。

2 结 果

2.1 引物特异性的检测 分别以结核分枝杆菌标准株H37Rv、结核分枝杆菌弱毒株H37Ra、BCG、牛分枝杆菌(C68003)、牛分枝杆菌(C68014)、禽分枝杆菌杆菌、龟分枝杆菌基因组DNA为模板，对LAMP方法的特异性进行检测。结果显示，3组引物均具有很高的特异性(表2)，阳性扩增反应产物经琼脂糖电泳，均出现了预期的阶梯式条带(图1-1、图2和图3)；同时对LAMP扩增产物进行了SYRB-GreenⅠ染色，阳性扩增反应产物均由橙色变为绿色，阴性反应产物均仍为橙色(图1-2)。

表2 esat-6、gyrB、mtp40引物特异性的检测Table 2 Specificity test of theesat-6,gyrBandmtp40

2.2 LAMP扩增反应的灵敏度检测 采用LAMP进行检测时，质粒浓度稀释倍数为107的模板仍可以扩增得到阶梯式的目标条带，而常规PCR在质粒稀释倍数为105仅隐约观察到条带，比LAMP低了两个稀释度。根据2.6中不同浓度的质粒的OD值换算质粒数，对不同稀释浓度的质粒数取平均值，结果表明3个重复实验的最大数值为7拷贝/反应，因此可以估算本实验建立的检测痰样本结核分枝杆菌LAMP方法可以检测到7拷贝/反应(图4)。

2.3 LAMP扩增反应临床样本符合率的检测 结果如表3所示，细菌分离培养阳性为20份，阴性为40份；常规PCR检测阳性为22份，而且均为结核分枝杆菌，阴性为38份；LAMP检测阳性为22份，均为结核分枝杆菌，阴性为38份。经分析，LAMP检测方法与细菌培养的符合率为90.91%，与常规PCR检测结果的符合率为100%。

表3 LAMP扩增反应临床样本符合率的检测结果Table 3 Coincidence test of LAMP in clinical samples

2.4 LAMP扩增产物的酶切鉴定 为了验证LAMP扩增产物，实验中采用3种限制性内切酶，分别为PstⅠ(可消化esat-6，得到146 bp和66 bp的片段)，SphⅠ(可消化gyrB，得到111 bp和74 bp的片段)，EcoRⅠ(可消化mtp40，得到 140 bp和 66 bp的片段)(图 5)。

3 讨 论

近20年来，在世界范围内结核病的发病率出现了回升的趋势，如不采取强有力的措施，将造成更为严重的流行和威胁[9]。涂片镜检和分离培养是结核杆菌最常用的检测方法。然而，涂片镜检的敏感性较低，需每毫升标本中至少有104个～105个结核分枝杆菌，分离培养至少每毫升标本中有103个～104个结核分枝杆菌才可检出，而且涂片镜检不能区别结核分枝杆菌和非典型分枝杆菌。分离培养至少4周～6周才可培养出结核分枝杆菌。特别是微量菌、细胞壁缺陷菌和化疗后细菌受到损伤培养难以生长，就更突出了培养的局限性。LAMP是对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增的一种新型的核酸扩增技术[8]。该技术只需一恒定温度就能完成扩增反应，不需要特殊试剂和仪器设备，不需要预先进行双链DNA的变性，并且扩增结果可通过加入荧光染料SYRB-GreenⅠ直观的判断，大大提高了其可操作性。本实验筛选了3个基因建立多位点环介导等温扩增的方法(1)大多数致病性结核杆菌所共有的基因esat-6[10-11]，该基因可有效鉴别诊断致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌，亦可区分卡介苗免疫和自然感染；(2)gyrB基因为结核分支杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌所共有[12]，而且前两者的同源性达到99.9%，前两者与后者的同源性分别为81.1%和81.3%，本实验选取结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与禽分枝杆菌的300 bp的差异序列，设计引物并进行LAMP检测，可将禽分枝杆菌与结核分枝杆菌和牛分枝杆菌区分开；(3)mtp40基因为结核分枝杆菌的种特异性基因[13]，可准确的诊断结核分枝杆菌，为流行病调查提供依据，并可指导临床用药。

研究结果表明，实验建立的LAMP诊断方法不仅具有很高的特异性，可区分致病性结核分枝杆菌和非致病性结核分枝杆菌，鉴别诊断自然感染和人工免疫，亦可准确判定结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，并在60 min内获得结果。有研究表明，如果再加一对环状引物，可将反应时间缩短一半[14]，但本实验所选基因片段并不适合设计环状引物，所以未作检测。在灵敏度方面，实验建立LAMP诊断方法可检测到7个质粒拷贝/反应，比常规PCR高100倍。有研究表明如果将反应时间缩短到35 min，虽然会降低检测的灵敏度，但仍可鉴定固体培养基上的分枝杆菌[12]。在准确性方面，实验将LAMP检测结果与分枝杆菌鉴别培养基培养结果以及常规PCR检测结果做了对比。经分析发现，LAMP检测结果与鉴别培养结果的符合率为90.91%，与PCR检测结果的符合率为100%，造成这种结果的可能原因是细菌培养检测的灵敏性较低，当每毫升痰液中的含菌量少于103个～104个时分离不到结核分枝杆菌。

总之，LAMP是一种快速、高特异、高灵敏度的新型核酸检测技术。由于其不需要复杂的仪器设备，而且可通过肉眼可视的方式快速判断检测结果，很适合在基层广泛推广应用。

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