红树林内生真菌Paecilomyces sp.(tree1-7)蒽醌类代谢产物研究

李新兰 徐 颖 潘冬瑞 张 亮 郭志勇 邹 坤

(三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室,湖北宜昌 443002)

红树林是生长在热带及亚热带海岸潮间带一大类特殊的植物,具有耐盐,耐淹等特性,特别是在涨潮期间能为许多海洋动物提供食物及庇护场所,形成一类非常特别的生态系统.正因为红树林奇特的环境造就寄生其中的微生物能够产生具有各种活性的不同代谢产物,林永成等从红树林内生真菌中分离到一系列结构新颖活性好的化合物[1-6].在从红树林内生真菌中寻找抗肿瘤活性代谢产物过程中,发现红树林内生真菌Paecilomyces sp.(tree1-7)的粗提物具有较强的抗肿瘤活性.在进一步分离过程中分离得到Tetracenomycin D,Physcioin,Emodin,1,4-Dihydroxy-2-methy anthraquinone和Chrysophanol等5个蒽醌类衍生物,同时用MT T法评价其对鼻咽癌细胞KB和KBv细胞的活性.

1 实验部分

1.1 试剂与实验仪器

X-4数字显示显微熔点仪(温度未校正)(北京泰克仪器有限公司);Bruker DRX-500核磁共振波谱仪;Finnigin电喷雾质谱仪;Varian prostar高效液相色谱仪;AL204电子天平(MET T LWR TOLEDO);S-3100紫外分光光度计(SCINCO);N-1001型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)等.柱色谱和薄层色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂产品,其它试剂均为分析纯.

1.2 菌种

Tree 1-7菌株是采自中国台湾海峡红树林的树皮腐生真菌,属Paecilomycessp.,鲜黄色密集型生长.由厦门大学郑忠辉教授提供,菌种分别保存在厦门大学化学化工学院和中山大学化学与化学工程学院天然产物研究室内.保存在 4℃的PDA+2.0%NaCl的培养基中.

1.3 菌种发酵培养

采用悬浮培养方式:发酵培养基(w)为葡萄糖0.5%,蛋白胨0.1%,酵母膏 0.05%,粗海盐0.2%,pH 7.0,500 mL三角瓶内装培养液 300 mL,经121℃(0.1MPa)高温灭菌25min后在超净工作台上接种.共接种150 L,28℃静置培养40d.

1.4 提取分离

发酵液用纱布过滤,菌体和发酵液分别收集,发酵液浓缩,150 L浓缩至5 L,用乙酸乙酯萃取.菌体晒干,甲醇浸泡后浓缩,提取浓缩物分别拌硅胶过柱,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗.收集各组分再反复柱层析,制备薄层层析,HPLC和重结晶纯化,分别得到化合物1～7.

1.5 抗癌活性实验

用MT T法检测5个蒽醌类化合物对KB和KBv细胞的细胞毒活性.从母液开始,依次4倍稀释,共5个梯度.对数生长期的KB和KBv细胞分别接种于96孔板,每孔100μ L(约1×104个细胞/孔),6h后加入不同浓度药物100 μ L,每一浓度3个重复孔.培养24 h后加入MT T 10 μ L(质量浓度为 5 mg/mL).继续培养4 h后弃上清,每孔加入二甲基亚砜100μ L后用酶联免疫检测仪测定492 nm处吸光度OD值,计算细胞生长抑制率.细胞生长抑制率=(实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%.KB和KBv细胞的细胞毒实验由中山大学医学院肿瘤医院的符立梧教授测试.

2 结果与讨论

2.1 结构解析

化合物1为红色固体,熔点210～212℃.EI-MS(M+):350.其一维氢谱碳谱明显显示出醌类的特征.其一维氢谱中在高场区仅有δ 3.95,2.37ppm的甲氧基和甲基,芳香质子的δ7.69,7.52,7.42,7.14,6.71 ppm,活泼羟基的δ13.35,12.44,12.35ppm.而其一维碳谱除了δ55.9,25.0 ppm的甲氧基和甲基外其它的均在芳香区和不饱和酮羰基的碳信号.其中芳香区的氢的偶合常数只有3.3,2.4 Hz,这说明δ 7.69,7.52ppm的氢是间位的,同样的7.42,6.71ppm也是间位的.通过与文献数据对比发现化合物1与tetracenomycin D的光谱数据一致.Tetracenomycin类化合物是1979年 Weber H[7]等人从 sreptomyces glaucescens中分到一系列的衍生物.这类化合物具有好的抑制微生物生长及抑制肿瘤细胞的活性而受到化学家的广泛关注.Careron D W[8]等于1992年合成了tetracenomycin及衍生物.

化合物2为橙红色固体,熔点202～203℃,EIMS谱给出分子离子峰m/e 284[M]+,结合氢谱和碳谱,推出其分子式为C16H12O5,计算不饱和度为11.碳谱提示存在 10个季碳(其中2个羰基碳),4个CH,2个CH3.具有典型的蒽醌骨架特征,并解释了所有不饱和度.氢谱中2个甲基均为单峰δ3.94(s,3H),2.45(s,3H),在 δ7.63(dd,1.5,0.5 Hz,1H),7.37(d,2.5 Hz,1H),7.08(dd,2.5,1.0 Hz,1H),6.69(d,2.5Hz,1H)ppm出现的4个芳香质子之间的偶合常数比较小,表明它们之间是远程相关,应处于间位.另外在δ12.31(s,1H)和12.11(s,1H)ppm出现2个酚羟基质子,信号比较强,提示它们与羰基之间形成了氢键,综合解析谱图得出化合物2的结构.大黄素甲醚(physcioin)的熔点文献值分别为209～210℃[9]和 197～ 198℃[10],与本化合物 202～203℃比较吻合,进一步对比其氢谱和碳谱,确证其结构与大黄素甲醚一致.大黄素甲醚是常用中药大黄的主要有效成分之一.大黄具有清热泻下作用,内服治疗肠胃积滞、大便不通,外用治疗烧伤并具有较强抑菌作用.

化合物3为橙色针状结晶,熔点256～257℃,分子式为C15H10O5,EI-MS显示分子量为270,由菌体中得到,易溶于CHCl3,EtOAc与CH3OH,几乎不溶于乙醇及碱溶液.从氢谱中可以看出有两个螯合的羟基 δ 12.17,12.05ppm,一个羟基在 δ 10.18 ppm,两组间位的芳香氢取代δ 7.55,7.12 ppm与δ 7.24,6.65 ppm,及一个苯环上取代的甲基δ 2.47ppm.碳谱中有两个明显的羰基峰δ 192.5,182.9 ppm.通过与文献[11]对照NM R数据,证明是大黄素(9,10-蒽二酮).大黄素首次由Penicillium spp.中分离得到,并且近期报道在Cascara sagrada中也分离得到.是一种很好的抗菌剂,抗肿瘤药及通便药,它还显示抑制一元胺氧化酶活性,并且它的危险性和毒性是 LD50=35 mg/kg[9].

化合物4为橙红色固体,熔点为 178～179℃,其EI-MS显示其分子量为254.其氢谱中低场区有2个活泼氢的信号分别为δ 12.11,12.00 ppm,表明该羟基有可能与γ-位羰基形成氢键,在芳香质子信号区有5个质子信号 δ 7.83(dd,0.9,7.5,1H),7.65(m,2H),7.29(dd,1.2,8.4,1H),7.10(s,1H),可以看出该化合物有一个邻二取代的苯环和一个五取代苯环存在.其高场区仅有一个连苯环的甲基存在.在其碳谱中显示出 15个碳,其中有 5个 CH,一个CH3,这与其一维氢谱是一致的,还有 9个季碳,其中 δ 192.37,181.81 ppm的季碳可能是两个与苯环共轭的羰基,推测其有可能是一个蒽醌类化合物.还有δ 162.59,162.30 ppm的季碳表明其中苯环上有两个连有羟基的碳存在.其它的季碳均在芳香区更加确定了化合物4是一个蒽醌类化合物.与文献[11]对照确定其结构如图所示.因为该化合物具有抗肿瘤活性及抑制多种微生物的活性,Singh Ram[12]等合成了化合物4,并研究了药理活性与结构的关系.

化合物5是金黄色固体.由菌体中得到,易溶于CHCl3,EtOAc与CH3OH.从氢谱中可以看出有两个螯合的羟基δ 12.11,12.00 ppm,一组间位的芳香氢δ 7.65,7.09 ppm,及3个邻位的芳香氢δ 7.81,7.65,7.09 ppm及一个苯环上取代的甲基δ 2.48 ppm.碳谱中有两个明显的羰基峰δ 192.4,181.8 ppm.与已知化合物chrysophanol相比,他们有相同的NMR数据.Chrysophanol由Monilinia fructicola中分离得到,是一种很好的抗菌剂,通便药[13].

化合物6为一白色针状晶体,熔点198～199℃.其一维谱显示该化合物是甾醇类结构.与麦角甾醇的氢谱比较发现就是在δ 2.03ppm处多了一个甲基,而碳谱的区别在于多了δ 170.3,30.5ppm.据此推断6可能是乙酰化的麦角甾醇.与文献对比确定化合物6就是乙酰化的麦角甾醇[14].

化合物7:白色晶体,mp:246～248℃.T LC与标准品三羟基麦角甾醇对比是同一化合物.

图1 化合物1-7的结构

2.2 抗癌活性

通过M TT法测试5个蒽醌类化合物可以抑制鼻咽癌细胞(KB,KBv)的活性,结果显示蒽醌化合物1-5对鼻咽癌细胞有不同程度的抑制活性.

表1 化合物1-5对KB及KBv活性数据

2.3 化合物的物理和波谱数据

化合物1实验数据:红色固体,mp 210～212℃.EI-MS:350;1H NMR(300 MHz,CDCl3):13.35(br s,1H),12.44(br s,1H),12.35(br s,1H),7.69(d,3.3,1H),7.52(d,3.3,1H),7.42(d,2.4,1H),7.14(s,1H),6.71(d,2.4,1H),3.95(s,3H),2.37(s,3H).13C NMR(75 MHz,CDCl3):185.0(C),182.2(C),165.5(C),162.9(C),162.2(C),157.6(C),139.2(C),136.1(C),129.5(C),126.9(C),127.6(C),125.7(C),116.8(CH),116.1(CH),114.7(CH),106.8(CH),105.4(CH),55.9(CH3),25.0(CH3).

化合物2:橙红色固体,mp 202～203℃,EI-MS(m/z):285[M+H]+;13C NMR(CDCl3,75 MHz):190.8(s),182.0(s),166.6(s),165.2(s),162.5(s),148.4(s),135.3(s),133.2(s),124.5(d),121.3(d),113.7(s),110.3(d),108.2(s),106.8(d),56.1(q),22.1(q);1H NMR(CDCl3,300 MHz):12.31(s,1H),12.11(s,1H),7.63(dd,1.5,0.5 Hz,1H),7.37(d,2.5Hz,1H),7.08(dd,2.5,1.0Hz,1H),6.69(d,2.5 Hz,1H),3.94(s,3H),2.45(s,3H);IR(KBr)ν:3432,3333,3130,1639,1613,1453,1401,1326,1273,1226,1163,1099,874,850,758 cm-1;UV(CH3COCH3)λ max:212,284,324,433 nm.

化合物3:橙色针状结晶.mp 251～253℃.1H NMR(Acetone-d6,300 MHz):12.17(1H,s),12.05(1H,s),10.18(1H,s),7.55(1H,d,J=1.2 Hz),7.24(1H,d,2.4 Hz),7.12(1H,d,0.6 Hz),6.65(1H,d,2.4 Hz),2.47(3H,s);13C NMR(Acetoned6,75 MHz):192.5,182.9,167.1,167.1,164.1,150.4,137.5,135.12,125.8,122.3,118.1,115.4,110.5,109.8,23.0.

化合物4:橙红色固体,mp178～179℃,EI-MS:254;1H NM R(300 MHz,CDCl3):12.11(s,1H),12.00(s,1H),7.83(dd,0.9,7.5,1H),7.65(m,2H),7.29(dd,1.2,8.4,1H),7.10(s,1H),2.48(s,3H);13C NMR(75MHz,CDCl3):192.4(C),181.8(C),162.6(C),162.3(C),149.2(C),136.8(CH),133.6(C),133.2(C),124.5(CH),124.3(CH),121.3(CH),119.9(CH),115.8(C),113.7(C),22.4(CH3).

化合物 5:金黄色固体.mp 199～200℃,1H NMR(CDCl3,300MHz):12.11(1H,s),12.00(1H,s),7.81(1H,d,6.6 Hz),7.65(2H,m),7.28(1H,d,7.5 Hz),7.09(1H,s),2.48(3H,s);13C NMR(CDCl3,75 MHz):192.4,181.8,162.6,162.3,149.2,136.8,133.6,133.3,124.5,124.3,121.3,119.8,115.9,113.7,22.8.

化合物6:1H NMR(CDCl3,300MHz):5.36(m,1H),5.24(dd,8,15 Hz,1H),5.17(dd,7.5,15 Hz,1H),4.11(m,1H),3.63(m,1H),2.03(s,3H),1.08(s,3H),1.02(d,7Hz,3H),0.91(d,7Hz,3H),0.84(d,7.5Hz,3H),0.82(d,7.5Hz,3H),0.60(s,3H);13C NMR(CDCl3,75MHz):δ170.3(C),141.9(C),135.1(CH),131.3(CH),118.1(CH),74.4(C),72.0(CH),65.9(CH),55.3(CH),54.1(CH),42.9(C),42.2(CH),41.9(CH),40.1(CH2),39.8(CH),38.9(CH2),36.6(C),32.4(CH),31.1(CH2),30.5(CH3),27.5(CH2),22.5(CH2),21.2(CH2),20.8(CH3),19.6(CH3),19.3(CH3),17.5(CH3),17.2(CH3),11.9(CH3).

化合物7:EI-MS m/z 413[M+1-H2O]+,395,377,341,307,227;IR(KBr)υmax(cm-1):3610,3442,2956,2870,1657,1457,1381,1310,1256,1163,1107,1030,967 cm-1;1H NMR(CDCl3,300 MHz):δ 5.36(m,1H),5.24(dd,8,15Hz,1H),5.17(dd,7.5,15Hz,1H),4.11(m,1H),3.63(m,1H),1.08(s,3H),1.02(d,7 Hz,3H),0.91(d,7 Hz,3H),0.84(d,7.5Hz,3H),0.82(d,7.5Hz,3H),0.60(s,3H).13C NMR(CDCl3,75MHz):δ141.9(C),135.1(CH),131.3(CH),118.1(CH),74.4(C),72.0(CH),65.9(CH),55.3(CH),54.1(CH),42.9(C),42.2(CH),41.9(CH),40.1(CH2),39.8(CH),38.9(CH2),36.6(C),32.4(CH),31.1(CH2),27.5(CH2),22.5(CH2),21.2(CH2),20.8(CH3),19.6(CH3),19.3(CH3),17.5(CH3),17.2(CH3),11.9(CH3).

3 结 语

综合文献及本实验的研究结果表明:红树林内生真菌次级代谢产物具有化学结构新颖,良好的抗肿瘤活性,具有潜在的药用价值和良好的开发前景.

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