脑红蛋白与 Caspase-3在大鼠海马CA1区的相关性

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(遵义医学院第五附属(珠海)医院,广东珠海 519100)

2000年 Burmester等[1]首次报道人和小鼠大脑神经元中存在脑红蛋白(NGB)。NGB在缺氧状态下能够特异性地向脑组织供氧,促进神经系统氧摄取、氧运输和氧利用等[2]。Caspase-3[3]是 Caspase家族中最关键的凋亡蛋白酶,在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。2008年 9月～2010年 1月,本研究采用免疫组化法与原位杂交法对大鼠大脑海马 CA1区的 NGB与 Caspase-3表达变化来探讨 NGB与 Caspase-3在脑缺血再灌注损伤的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠与分组 健康 SD大鼠 60只,由遵义医学院珠海校区实验动物中心提供,体质量 250～350 g。随机分为对照组和实验组,各 30只,每组按再灌注的时间(3、6、12、24、48 h)又分为共 5个观察时间点,每个时间点 6只大鼠。

1.2 试剂 兔抗大鼠 NGB多克隆抗体(浓缩型),兔抗大鼠 Caspase-3多克隆抗体(即用型),Caspase-3mRNA原位杂交试剂盒,原位杂交专用 PBS缓冲液,TBS缓冲液,2×SSC缓冲液均由武汉博士德提供。NGBmRNA原位杂交试剂盒由上海和乐生物科技有限公司提供。

1.3 模型制作 采用 Pulsinelli-Brierley四血管阻塞法建立急性全脑缺血再灌注损伤模型。大鼠称重后以5%异戊巴比妥钠按 100mg/kg麻醉,枕下至第五颈椎正中纵行剪开皮肤,止血钳钝性分离暴露双侧横突孔,电凝双侧椎动脉,24 h后分离双侧颈总动脉,用无损伤动脉夹夹闭双侧颈总动脉,大鼠的角膜反射、翻正反射消失、眼球 2～3 s即变灰、毛发可竖起,15min后撤去无损伤动脉夹造成再灌注;对照组只暴露横突孔,不阻塞椎动脉;只分离颈总动脉,不夹闭。实验中有翻正反射、一直抽搐、能吸水者、眼球不变灰者弃之。

1.4 检测方法 两组分别在缺血再灌注后 3、6、12、24、48 h断头取脑,放入 4%的多聚甲醛液中固定、蜡块包埋、切片、烤片,免疫组化按 SABC法进行检测,原位杂交按其说明书进行操作。成片Leica DM LB2光学显微镜下观察,通过 IBM摄像系统,运用 Viewfinder拍照、采图软件进行采图保存。采用 Image Pro Plus6.0图像分析系统对所采图象进行光密度值测量。存活神经元数目采用HE染色,光镜下用尺型计数器计数海马区0.5mm存活的神经元数目,光镜倍数为 10×40。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 16.0统计软件,结果以±s表示,各组内比较采用单因素方差分析并用 q检验进行两两比较,两组间各时间点单独比较采用独立样本 t检验,各组间用 Spearman法进行相关性分析,以 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色后大鼠大脑海马 CA1区存活锥体细胞数的变化见表1。

2.2 各组大鼠大脑海马 CA1区 NGB与 Caspase-3表达的光密度值及其相关性 见表2。实验组海马 CA1区 NGB与 Caspase-3呈负相关(r=-0.798,P=0.00)。

2.3 各组大鼠大脑海马 CA1区 NGBmRNA与Caspase-3mRNA表达的光密度值及其相关性 见表 3。实验组海马 CA1区 NGBmRNA与 Caspase-3 mRNA呈负相关(r=-0.854,P=0.00)。

表1 再灌注后海马 CA 1区存活锥体细胞数(个/mm,±s)

表1 再灌注后海马 CA 1区存活锥体细胞数(个/mm,±s)

注:与对照组比较,*P＜0.01

组别 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h对照组 83.83±3.66 82.17±2.23 83.16±2.32 84.00±3.58 83.29±2.53实验组 62.39±2.86 42.83±4.36* 34.00±4.10* 17.83±2.64* 5.00±1.41*

表2 再灌注后海马 CA 1区细胞中 NGB与 Caspase-3表达的光密度值(±s)

表2 再灌注后海马 CA 1区细胞中 NGB与 Caspase-3表达的光密度值(±s)

注:与对照组比较,*P＜0.05,△P＜0.01

组别 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h对照组NGB 0.148±0.012 0.15±0.008 0.143±0.013 0.149±0.011 0.153±0.007 Caspase-3 0.079±0.003 0.081±0.004 0.082±0.006 0.080±0.003 0.081±0.006实验组NGB 0.150±0.001 0.146±0.005 0.124±0.002* 0.105±0.003△ 0.085±0.001△Caspase-3 0.083±0.008 0.113±0.005△ 0.136±0.005△ 0.168±0.007△ 0.147±0.005△

表3 再灌注后海马CA 1区细胞中 NGB mRNA与 Caspase-3mRNA表达的光密度值(±s)

表3 再灌注后海马CA 1区细胞中 NGB mRNA与 Caspase-3mRNA表达的光密度值(±s)

注:与对照组比较,*P＜0.05,△P＜0.01

组别 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h对照组NGBmRNA 0.094±0.006 0.093±0.005 0.093±0.001 0.092±0.007 0.090±0.003 Caspase-3 mRNA 0.089±0.002 0.090±0.003 0.090±0.004 0.088±0.006 0.089±0.004实验组NGBmRNA 0.095±0.004 0.091±0.002 0.073±0.008* 0.049±0.005△ 0.042±0.002△Caspase-3 mRNA 0.091±0.004 0.142±0.018△ 0.171±0.007△ 0.207±0.008△ 0.189±0.005△

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是脑缺血难以避免的损伤过程。NGB与Caspase-3是脑缺血损伤过程中表达明确的对立因素[4,5]。但其对立性是通过何种途径及其哪些因素参与损伤的过程目前研究不是很明确。本实验从基因与蛋白角度分别从多个时间点观测 NGB与Caspase-3表达变化,表明两者之间的相互制约性,但在时间上波动性的具体机制不是很明了。缺氧耐受因子-1a(HIF-1α)[6]是一种对低氧敏感性因子,在缺氧状态下表达量有迅速、短暂的升高,缺氧激活后通过启动下游低氧反应元件参与组织的保护。研究[7]认为 NGB可能是其下游反应基因表达的产物;但同时大量研究发现在严重缺氧或持续缺氧的组织中 HIF-1α可以促进细胞的凋亡,可能与 HIF-1α聚集 P53的表达所致。P53作为转录因子可以诱导一系列下游基因的表达,介导细胞停止在 G1期,使受损的 DNA有足够时间得到修复,如果修复失败,则启动凋亡程序,通过降低细胞内源性 Bcl-2,提高细胞内 Bax蛋白的表达,激活Caspase-3等发挥促凋亡的作用。陈婷芳等论证了NGB启动区存在 P53结合位点,P53具有增强 NGB的转录功能。因此组织细胞在缺血凋亡中的动态演变应该是失衡—修复—凋亡;这与实验数据在时间上差异性表达趋于一致。海马 CA1区是缺血敏感区,神经元抵御缺氧能力最低,缺血缺氧诱导一系列抗损伤因子(HIF-1α、P53等)的表达同时也潜伏了凋亡因子的转录。此外,NGB与Caspase-3之间的负相关关系实际上是一种时间上的轮替关系,为临床早期干预缺血后的再灌注损伤提供了依据。

可见,大鼠全脑缺血再灌注后,海马区 NGB的表达有助于神经元功能的恢复,并随时间呈递减性表达,且与 Caspase-3呈负相关关系。

[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,etal.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520-523.

[2]Khan AA,Mao XO,Banwait S,et al.Regulation of hypoxic neuronal death signaling by neuroglobin[J].FASEB J,2008,22(6):1737-1747.

[3]Tanaka H,Yokota H,Jover T,et al.Ischemic preconditioning:neuronal survival in the face of caspase-3 activation[J].JNeurosci,2004,24(11):2750-2759.

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[5]陈浩,臧贺川,伊红丽,等.一氧化碳中毒大鼠脑红蛋白表达变化及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3表达的影响[J].中国临床康复,2006,10(2):73-76.

[6]李佩尧,张成岗.细胞内低氧感受器:缺氧诱导因子-1脯氨酰羟化酶研究进展[J].生理科学进展,2007,38(1):62-64.

[7]Zhang C,WangC,Deng M,et al.Full-length cDNA cloning of human neuroglobin and tissue expression of rat neuroglobin[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(5):1411-1419.