高效液相-荧光检测法测定乌灵胶囊中14种氨基酸的含量

何新荣， 刘 萍

(中国人民解放军总医院药品保障中心中药房，北京100853)

乌灵胶囊为发酵乌灵菌粉制成的胶囊，其主要的成分是腺苷、多糖、多种氨基酸，其中有多种为人体不能自身合成的必需氨基酸。《中国药典》收载了其质量控制标准为高效液相色谱法测定腺苷的含量(为新增的方法)和紫外分光光度法测定多糖的含量［1］。查阅乌灵胶囊相关文献［2-6］，氨基酸类成分是乌灵胶囊的主要成分之一，但关于其相关含量测定研究甚少。为了更科学地控制乌灵胶囊的质量，本实验对乌灵胶囊中多种氨基酸的含量进行了定量测定，为其质量控制提供科学有效的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国)，G1329A自动进样器，数据由Agilent Chemstation on-line系统处理，G1315D荧光检测器(FLD)，色谱柱为 Alltima C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。电子天平(Sartorius CP225D);PHS-2C计(上海虹益仪器仪表);KQ2200DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器)。

1.2 试药 天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Iso)、亮氨酸(Leu)、胱氨酸(Cys)、色氨酸(Try)、赖氨酸盐酸盐(Lys-HC)对照品(中国药品生物制品检定所，批号:624-200104);γ-氨基丁酸(γ-GABA，026K0736);乌灵胶囊(浙江佐力药业股份有限公司，批号:20071203，20071204，20080306，20080308);磷酸氢二钠、邻苯二甲醛(phthalaldehyde，OPA)、2-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，2-MCE)均购于Sigma公司;甲醇为国产色谱纯试剂;硼酸、磷酸等均为国产分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Alltima C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为 A:磷酸氢二钠缓冲液(0.1 mol/L，pH=6.86)，B:甲醇;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;发射波长:340 nm，检测波长:450 nm。梯度洗脱溶剂比例见表1。

表1 梯度洗脱溶剂比例

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取14种氨基酸对照品，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解，配成每1 mL含氨基酸200 nmol/mL标准混合溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取4个批号乌灵胶囊各10粒，倾出内容物，研匀，分别取0.5 g，精密称定，置25 mL 量瓶中，加20 mL 0.1 mol/L HCl溶液，超声振荡提取20 min，放冷，过滤，滤渣再用20 mL 0.1 mol/L的HCl溶液超声提取20 min。合并两次提取液，用双蒸水定容至50 mL，滤过，滤液再用0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为待测样品，备用。

2.4 衍生试剂的制备 精密称定12.5 mg OPA，0.25 mL甲醇溶解后，加入2.5 mL 硼酸缓冲液(0.4 mol/L，pH=9.5)，蜗漩混匀，再加入 10 μL β-巯基乙醇，冰箱中保存备用。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系 取2.2项下标准品试液、0.1 mol/L 盐酸溶液稀释成 6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/mL。按2.1 项下色谱条件，柱前衍生法进样5μL进行检测，以氨基酸峰面积(A)为横坐标，氨基酸浓度(C)为纵坐标运用Agilent校正功能进行线性回归，回归方程详见表2，结果表明，14种氨基酸均在一定检测浓度范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5.2 精密度实验 混合标准品溶液，按2.1项下色谱条件，柱前衍生法(编辑Agilent1200进样程序，先抽取衍生试剂，接着抽取供试品试液，混合后静至2 min，进样)进样5次，进样量5 μL。记录14种氨基酸峰面积和保留时间，其RSD分别为0.18%～1.32%和0.21% ～2.09%。表明精密度良好。

表2 氨基酸的标准曲线

2.5.3 重复性实验 按照2.3项下制备样品溶液的方法平行制备5份样品溶液，分别按照2.1项下色谱条件，柱前衍生法进样5μL。记录14种氨基酸峰面积和保留时间，其RSD分别为0.21% ～2.12%和0.31% ～2.14%。表明重复性良好。

2.5.4 稳定性实验 乌灵胶囊样品提取液分别于提取后 0、30、60、90、120、150 min(柱前衍生法)进样，记录各种氨基酸的峰面积，计算峰面积的RSD为0.42% ～1.87%，显示乌灵胶囊的盐酸水提液中氨基酸在150 min内基本稳定。

2.5.5 回收率实验 采用加样回收试验。取6份已知氨基酸含量的乌灵胶囊粉末，各加入对照品溶液按2.3项下处理样品，衍生后测定，计算回收率。各氨基酸的回收率在90.34% ～99.52%之间，RSD为0.80% ～1.99%。

2.6 样品含量分析

将2.3项下制备的供试液，按2.1项下色谱条件，在线柱前衍生法进样。

图1表明，15种氨基酸都存在于乌灵胶囊中，除His与Gly不能分离开外，各氨基酸分离度较好，空白杂质峰(衍生剂峰)对测定无影响。从表3中含量数据可知，γ-GABA含量最高，Met含量最低。其中以His计 His与Gly的含量，大部分氨基酸在4个批次中的含量标准偏差较小，表明各批次样品含量控制稳定，也说明了本方法有很好的实用性。

图1 氨基酸标准品A、乌灵胶囊样品B与空白对照组C的HPLC-FLD色谱图

3 讨论

在植物药中氨基酸是重要的有效成分，其中谷氨酸可促进人体内消化液的分泌，具有预防贫血及解毒作用;精氨酸可控制体内细胞的退化;胱氨酸是毛发的成分，具有促进毛发生长和防止皮肤老化作用，也可用于抗过敏、肝炎、白血球减少等症;苏氨酸在人体内有转变氨基酸达到平衡的作用［7］;特别是γ-GABA，作为脑中抑制性神经递质，是脑内睡眠觉醒系统的物质基础，有可能是乌灵胶囊发挥镇静、安神作用的重要基础物质，因此正确地利用和进一步研究监控这些氨基酸，对充分发挥乌灵胶囊等靠氨基酸发挥治疗作用的药物价值具有重要意义。

OPA衍生化方法是目前使用较为广泛的衍生技术［8］，具有样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高的优点。试验中发现，其pH值大小在本实验中至关重要，OPA衍生化反应要求pH＞9，因为在pH 5～6时衍生产物最易降解［9-11］。

本实验采用HPLC-FLD法，柱前衍生进样对4个批次乌灵胶囊中14种氨基酸的含量进行测定，结果准确，精密度高，重现性好，操作较为简单方便，尤其是流动相较其他报道文献［3，6］有了很大改进，避免了复杂的流动相配制工作，因此本方法可用于乌灵胶囊中氨基酸的含量测定。同时我们也对乌灵胶囊中其它氨基酸进行了检测，可能由于不含或含量低，未能检测出。

表3 4批次乌灵胶囊中氨基酸的含量测定结果

［1］中国药典［S］.一部.2005:397.

［2］吴强恩，郑力行.反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质［J］.复旦学报:医学版，2005，32(3):355-358.

［3］张孝松，储著银，黄 龙.柱前衍生-反相高效液相色谱分析复方氨基酸注射液［J］.药物分析杂志，1996，16(1):6-9.

［4］裘 涛，陈 眉，陶水良.乌灵菌粉对脑卒中后抑郁大鼠海马区单胺类神经递质及行为学改变的影响［J］.中国新药杂志，2007，16(11):857-860.

［5］廖名龙，郁 杰.乌灵胶囊［J］.中国新药杂志，2000，9(11):797-799.

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［7］岳云飞，王振月，王谦博.柱前衍生反相高效液相色谱法测定毛脉酸模根中氨基酸的含量［J］.时珍国医国药，2007，18(9):2069-2070.

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［9］盛国庆，张晋蓉，颜 梅.高效液相测定氨基酸类神经递质的方法探讨［J］.徐州医学院学报，2002，20(1):34.

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［11］Ibolya MP.Derivatization and chromatographic behavior of the ophthaldialdehyde amino acid derivatives obtained with various SH-group-containing additives［J］.Chromatogr A，2001，913:283.