当归补血总苷HPLC指纹图谱研究

黄赵刚， 高 建，2，3*， 李 萍， 高 雷， 朱冬春， 夏 泉， 许杜娟，3

(1.安徽医科大学第一附属医院药剂科，国家中医药管理局中药化学三级实验室，安徽 合肥230022;2.中国药科大学“现代中药”教育部重点实验室，江苏南京210009;3.安徽医科大学药学院，抗炎免疫药理学安徽省重点实验室，安徽合肥230032)

当归补血汤系中医经典名方，始载于李东垣的《内外伤辨惑论》，按黄芪-当归为5∶1组成，具补气生血、扶正固本等功效，临床上用于多种疾病的治疗。现代药理研究表明［1-4］:当归补血汤具有促进造血、调节免疫功能、保护心脑血管、抗纤维化、对化疗药具增效减毒等作用。当归补血总苷是当归补血汤皂苷类总成分，为其主要活性部位之一，本文建立了当归补血总苷的HPLC指纹图谱，意在加强其质量控制。

1 仪器及试药

1.1 仪器 A gilent 1100高效液相色谱仪(ALS自动进样器，四元泵)，DAD检测器，分析天平(Mettler Toledo AG285)。

1.2 试药 乙 腈(HPLC级，CALEDON公司)，水为纯化水。黄芪、当归药材均由本院中药库提供，购自南京医药合肥天星有限公司，经鉴定黄芪为膜荚黄芪Astragalus membraceus(Fisch)Bge.，当归为 A ngelica sinesia(Oliv.)Diels 。

2 方法结果

2.1 色谱条件 色 谱柱:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水梯度洗脱，梯度程序(乙腈):0 ～7 min 8%，15 min 20%，30 min 30%，45 min 60%，50～55 min 100%;流速:1.0 mL/min;检测波长:203 nm;柱温:30℃ 。

2.2 供试品溶液的制备 取 黄芪、当归药材粗粉，称取黄芪、当归12.0 g(5∶1)，加10倍75%乙醇回流提取2次，合并醇提液趁热过滤，减压浓缩回收乙醇;浓缩物加适量蒸馏水溶解，水饱和正丁醇(1∶1)萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇后得粗总苷;粗总苷用大孔吸附树脂吸附，分别以蒸馏水，40%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，加流动相(乙腈-水=50∶50)溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2.3 对照溶液的制备 分 别取黄芪药材粗粉10.0 g、当归药材粗粉2.0 g，按2.2项下操作，得黄芪、当归单味药材对照液。

2.4 精密度试验 取 同一份供试品溶液，进样10 μL，连续进样5次，按2.1项条件分析，结果各峰保留时间的RSD小于1%，峰面积的RSD小于3%，说明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取 同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样10 μL，按2.1项条件分析，结果各峰保留时间的RSD小于2%，峰面积的RSD小于3%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6 重复性试验 取 同一批次黄芪、当归按2.2项下操作，一式5份，按2.1项条件进样10 μL，HPLC 分析，结果各峰保留时间RSD的小于2%，相对峰面积的RSD小于3%，以第1份为参比，其余各份的相似度大于0.971。说明重复性较好。

2.7 样品分析 分 别取不同批次供试品溶液、不同批次对照溶液，按2.1项条件进行分析，结果见图1，表1，表2。

图1 当归补血总苷、当归提取物和黄芪提取物HPLC图谱

表1 10批次当归补血总苷相对保留时间

表2 10批次当归补血总苷相对峰面积

3 结论与讨论

3.1 结论

通过对10个不同批次当归补血总苷的HPLC分析，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件进行指纹峰的分析，多点校正后进行自动匹配，确定了13个共有峰。10批样品共有峰面积占总峰面积百分比分别为:90.7、92.4、94.5、94.2、95.2、95.4、92.9、90.9、92.2、93.8;主要共有峰面积百分比见表3。经与单味药材HPLC图谱比较，其中1、3、5号峰为当归和黄芪单味药材提取物共有，13号峰归属当归，其余号峰归属黄芪。分析结果显示:13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的重现性较好，RSD分别为0.2% ～1.0%1.6% ～4.6%，表明本法重现性较好，10 个批次当归补血总苷的质量基本一致。

表3 主要共有峰面积占总峰面积百分比/%

将10批样品供试品溶液色谱图数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，自动匹配后生成对照图谱，以此作为当归补血总苷的对照指纹图谱，进行相似性评价。结果10 批样品的相似度分别为:0.921、0.937、0.955、0.948、0.959、0.967、0.938、0.932、0.934、0.942;10 批样品的相似度均大于0.9，说明以上述当归补血总苷制备工艺制备的样品一致性较好。

3.2 讨论

在HPLC指纹图谱流动相系统的选择中，分别对乙腈-水系统［5］、甲醇-水系统［6］进行考察，结果表明，乙腈-水系统分离效果较好，各峰的分离度良好，基线稳定，有利于指纹图谱的分析，因此采用乙腈-水梯度洗脱系统。由于当归补血总苷无明显特征紫外吸收，故选择检测波长为203 nm(末端吸收)。7号色谱峰相对分离较好，附近无其他峰干扰，峰面积适中，因此选择7号峰作为参比峰。

中药指纹图谱能够基本反映中药的整体宏观特征，可以从整体上准确、量化地对中药进行真伪鉴别和质量评价。计算并评定各个批次中药材产品的指纹图谱间的整体相似程度，根据整体相似程度来估算它们各自化学组成的整体波动程度，可以为有效控制中药材产品的质量提供科学可靠的依据。本实验研究不同批次制备的当归补血总苷样品的指纹图谱，实验的精密度、稳定性、重现性较好，指纹图谱的稳定性较好，能有效体现出对当归补血总苷鉴别的特征性和专属性，符合指纹图谱的要求，可用于当归补血总苷的质量控制。

［1］范 颖，陈信义.当归补血汤的实验研究进展［J］.中医药学刊，2006，24(9):1643-1645.

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