制川乌配伍白芍微波提取与传统提取工艺的比较研究

郑 琴， 郝伟伟， 乐志艳， 陆浩伟， 卢燕香， 杨 明

(江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004)

制川乌与白芍均具有镇痛、抗炎作用。制川乌发挥药效的主要成分为其所含的生物碱类物质，白芍中主要化学成分芍药苷。微波提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低等许多优点，是一种天然产物提取的新技术［1-3］。本实验以乌头总生物碱、芍药苷为指标，用紫外可见分光光度法、高效液相色谱法进行测定，采用正交设计优化工艺，将微波提取法用于制川乌与白芍配伍后乌头总碱及芍药苷的提取，通过比较传统提取法与微波提取法对有效成分煎出量的影响，为微波提取应用于中药有效成分的提取可行性提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HWC-3LA型微波提取设备(广州兴兴微波能设备有限公司);agilent 1200液相色谱仪(美国)，包括:四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、G1314B VWD紫外检测器;UV-2550型紫外可见-分光光度计(日本岛津公司);Sartorius BS124S电子分析天平。

1.2 试药 制川乌药材(购自江油恒源药业集团有限公司，产地:四川，批号:20080930)，白芍药材(购自黄庆仁大药房，产地:浙江，批号:20080925)，由中药鉴定教研室鉴定符合《中国药典》2005年版。对照品:乌头碱(购自中国药品生物制品检定所，批号:110720-200410)，芍药苷(购自中国药品生物制品检定所，批号:110736-200629)，乙腈(色谱纯，德国MOKER公司)，双蒸水(自制)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 乌头总生物碱的含量测定方法［4］

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱对照品适量，置25 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液，并添加至刻度，摇匀，即得0.149 mg/mL的乌头碱对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的制备 精密量取 0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 乌头碱标准品溶液，分别置分液漏斗中，各依次加入0.01 mol/L盐酸溶液 2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.00 mL，各精密加醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL，溴甲酚绿液2 mL，氯仿10 mL，振摇3 min，静置，分取氯仿层，照分光光度度法(附录V)在416 nm波长处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得回归方程:A=0.6678 C+0.115，r=0.9998，乌头碱在0.037～0.298 mg范围内呈良好的线性关系。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取40目制川乌、白芍药材粉末，加适量溶剂，分别进行微波和回流提取，提取液离心过滤，精密吸取10 mL，低温蒸干，残渣用10 mL蒸馏水溶解，加氨试液调节pH值10～11，用氯仿萃取4次，每次10 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加0.01 mol/L盐酸溶液，分次溶解，并转入25 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取供试品溶液与空白溶液各2 mL，分别置分液漏斗中，照2.1.2项下方法，自“各精密加醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL”起，依法测定吸收度，计算，即得。

2.1.4 乌头总生物碱收率的计算 按照《中国药典》2005年版一部制川乌项下的方法测得制川乌药材中乌头总生物碱以乌头碱计的质量分数为0.45%。

乌头总生物碱的收率=提取液中乌头总生物碱的质量/制川乌药材中总生物碱的质量×100%

M0为提取液中乌头总生物碱的质量;M1、M2分别为制川乌和白芍的生药材量。

2.2 芍药苷的含量测定方法

2.2.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶柱Hypersil ODS 2 C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸水(15∶85);柱温:30℃;检测波长:230 nm;流速:1.0 mL/min。

2.2.2 标准曲线的制备 精密称取芍药苷标准品适量，用50%甲醇溶解，配制40.80 μg/mL的芍药苷标准品母液。分别准确吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的对照品母液，置 1 mL 棕色量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，制得6个不同浓度的对照品溶液。取上述浓度对照品溶液，按2.1.2项下色谱条件分别进样10 μL分析。以芍药苷的浓度(μg/mL)为横坐标X，平均峰面积(A)为纵坐标Y，得回归方程 Y=25.924X-3.2414，r=0.9995，结果表明芍药苷在0.408～40.8 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取40目制川乌、白芍药材粉末，加适量溶剂，分别进行微波和回流提取，提取液离心过滤，精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，用65%乙醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 测定 精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，按标准曲线方程计算芍药苷的质量浓度。

2.2.5 芍药苷收率的计算 按照《中国药典》2005年版一部芍药苷项下的方法测得白芍药材中芍药苷的质量分数约为1.63%。

芍药苷的收率=提取液中芍药苷的质量/白芍药材中芍药苷的质量×100%

M0为提取液中芍药苷的质量;M1、M2分别为制川乌和白芍的生药材量。

2.3 浸膏得率的测定

精密量取提取液10 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，按下式计算浸膏得率。

W为10 mL药液的浸膏重量;V为提取液的体积;W0为药材重量。

2.4 制川乌白芍微波提取

2.4.1 实验因素与水平设计 分别选择微波功率、提取时间、提取溶剂浓度、溶剂用量作为四因素，进行三水平实验，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.4.2 微波提取的正交实验 按表2 L9(3)正交表设计的顺序进行微波提取。每份样品提取两次，合并提取液。精密量取适量提取液，照2.1～2.3项下乌头总生物碱、芍药苷及浸膏得率进行测定，测定结果见表2。方差分析结果见表3。

实验结果表明，直观分析:影响乌头总生物碱含量的各因素作用的主次为A＞D＞C＞B，影响芍药苷含量的各因素次序为:C＞B=A＞D，影响浸膏得率各因素次序为:C＞D＞A＞B;方差分析可见:对乌头总生物碱为指标性成分影响因素A、D存在显著性差异，对芍药苷及浸膏得率各因素不存在显著性影响，综上所述:确定提取工艺为A3B2C2D3:提取功率为:800 W，提取时间为:30 min，提取溶剂:65%乙醇，溶剂用量为10倍量。

表2 L9(34)正交试验设计表及结果

表3 方差分析

(续表3)

2.5 制川乌白芍回流提取

2.5.1 实验因素与水平设计 分别以提取时间、溶剂浓度、溶剂用量、提取次数作为四因素，进行三水平实验，因素水平表见表4。

表4 因素水平

2.5.2 传统回流提取的正交实验 按表5L9(3)正交表设计的顺序进行回流提取。精密量取适量提取液，照2.1～2.3项下乌头总生物碱、芍药苷及浸膏得率进行测定，测定结果见表5。方差分析结果见表6。

实验结果表明，直观分析:影响乌头总生物碱含量的各因素作用的主次为C＞D＞B＞A;影响芍药苷含量的各因素次序为:D＞A＞B＞C;影响浸膏得率各因素次序为:D＞B＞A＞C;方差分析可见:因素C、D对乌头类生物碱有显著性影响，而对其他指标性成分影响不显著。实验同时考虑到与微波提取工艺的可比性，确定最佳工艺为:A3B2C3D2，即提取时间:2 h，溶剂浓度:65%乙醇，溶剂用量10倍量，提取次数2次。

表5 L9(34)正交试验设计表及结果

表6 方差分析表

2.6 验证实验 按比例称取制川乌、白芍药材，分别按微波提取和传统回流提取的最佳提取条件提取，测定。结果见表7。

表7 工艺的验证及提取率比较

从表7可以看出，与传统提取方法相比，微波提取所需时间缩短7倍、溶剂的用量减少了1倍，乌头总生物碱的转移率为0.94倍，芍药苷的转移率提高到1.68 倍。

3 讨论

通过正交设计优化得到微波与传统提取制川乌配伍白芍的工艺条件，并经验证得出乌头总生物碱微波提取法的平均收率为80.31%，传统回流提取法为 85.13%;微波提取法芍药苷平均收率为45.51%，传统回流提取法为26.94%。试验结果表明，对乌头总生物碱而言，微波提取略比传统回流方法的提取率低，但微波提取法芍药苷的转移率是传统提取法的1.68倍，且微波提取法与传统的热回流法相比，大大缩短了提取的时间，节省了提取溶剂的用量，从而减低了生产成本。芍药苷对光、热不稳定，传统的热回流提取工艺，传热速度慢，易造成芍药苷在加热过程中慢慢分解。微波提取法具有快速提取的优点，减少了提取物在高温下的受热时间，从而有利于减少芍药苷类物质的分解。

微波提取技术已应用于生物碱类、蒽醌类、黄酮类、皂苷类、多糖、挥发油、色素等成分的提取。微波萃取技术作为一种新型的萃取技术，具有一定的适用范围，如微波对物质提取的选择性，以及对溶剂要求等方面。Ganzler K［1］等研究表明用极性溶剂提取极性物质，微波法比索氏等其他提取方法理想;但用非极性溶剂提取非极性物质微波提取并未显示优越性。

［1］Ganzler K，Salgo A，Valkok.Microwave extraction-a novel sample preparation method for chromatography［J］.J Chromatogr，1986，(371):299-306.

［2］龚盛昭，杨卓如.微波萃取黄芩甙的协同效应研究［J］.精细化工，2003，20(7):435.

［3］龚盛昭，程 江，杨卓如.微波场协同提取芦丁［J］.精细化工，2003，20(12):758.

［4］王苏会.抗风湿颗粒的制备工艺及质量标准研究［D］.北京:北京中医药大学，2005.