初步对乌灵参丙酮提取物官能团和化合物分析

卢金 何文迪 马少华 吴迪

(宁波卫生职业技术学院，浙江 宁波 315100)

乌灵参属子囊菌纲、炭角菌科的黑柄炭角菌，别名乌苓参、鸡(土从)蛋，又名雷震子，主要产于江苏、浙江、四川、云南、广东、江西等地，生长在地下深处黑翅土栖白蚁废弃的蚁巢上，是传统的药用真菌、食用菌，具有特殊的生物学特性、丰富的生理活性成分和广泛的药理作用，被世界药用真菌研究、应用领域均视为珍稀、名贵药材[1]。乌灵菌粉的镇静安神、抗失眠、抗抑郁、抗焦虑效果，在临床上己经得到证实，显示中医药在这方面的独特优势[2,3]。浙江佐力药业以乌灵菌粉制造的乌灵胶囊被国家确定为“一类新药”、“中药保护品种”进入国家医保目录，是用于治疗焦虑、抑郁和失眠等病症的唯一单方型中药制剂。

尽管乌灵参疗效得到了认可，但因其生长环境奇特，自然资源采掘非常困难，使得野外采集的乌灵参样品量有限，小分子化合物的分离纯化报道较少，所以对其研究及推广非常缓慢。目前，国内已有乌灵发酵菌丝生产的报道，乌灵参的应用才成为可能，从高等真菌中寻找新的药物以及生理活性物质是目前国内外药物研究的热点，作为一个具有广阔开发潜力的药用真菌，目前在产品开发上也仅以其发酵粉面世，所以乌灵参应用开发才刚刚开始。

1 乌灵参微观结构

图1是新鲜乌灵参切片后用苏木素伊红联合染色后，在光学显微镜下观察到的图片(放大1000倍)。从图1可以看出，新鲜乌灵参内部由丝状菌丝缠结组成，细胞壁较薄,细胞排列疏散且相互缠绕,菌丝细胞之间有大量的空隙，这应该是便于贮存空气和水分。

图1 新鲜乌灵参切片放大图(放大1000倍)

图2是用扫描电镜观察乌灵菌粉，可以看到其表面为复杂的无规则断面结构，符合植物及真菌类粉碎后的特征。从图2中可以看到菌粉表面有很多孔洞，这些孔洞的直径小于1μm。这种结构与图1在显微镜下观察到的大量丝状结构相一致。

图2 乌灵菌粉表面扫描电镜图片

2 乌灵参提取物体制备

新鲜乌灵参子实体在45℃条件下烘干后破碎成粉末状，然后用过80目筛子，利用超声波细胞破碎仪对乌灵菌粉的醇分散悬浊液超声破碎30min后，按照1∶10的料液比添加适量的80%丙酮，室温下浸提12h，采用旋转蒸发仪将浸提液浓缩成浸膏，即乌灵参丙酮提取物。

3 红外吸收光谱、液相色谱初步分析乌灵参提取物的主要官能团

用索氏抽提器分别使用水和丙酮为介质对本研究团队初步培养的乌灵参进行有效成分提取。用红光光谱对乌灵菌粉做了定性检测、用液相—质谱联用仪对提取的有效成分进行分析，实验数据见图3至图5。图3是提取前的乌灵菌粉红外光吸收谱，图4是提取后的乌灵菌粉红外光吸收谱，图5是乌灵参提取液的液相色谱峰。由于乌灵参的成分比较复杂，用现有的质谱数据库分析的结果与其它仪器的分析结果有偏差，所以现在以物质结构计算理论分析为主。目前，质谱测定的结果如下：最低质量是30D；最高质量是550D；第1个基团的第1个和第2个原子团的质量都是149D，这个基团中的质量分布为149D、167D、279D，保留时间均是30min；第2个基团的第1个原子团的质量是91D，第2个原子团的质量都是150D，这个基团中的质量分布为91D、149D、150D、206D，保留时间均是30min；第3个基团的第1个原子团的质量是149D，第2个原子团的质量都是150D，这个基团中的质量分布为149D、150D、167D、279D，保留时间均是30min；第4个基团的第1个原子团的质量是149D，第2个原子团的质量都是167D，这个基团中的质量分布为149D、150D、167D、279D、263D、293D、307D，保留时间均是30min。

图3 提取前的乌灵参粉红外光吸收谱

图4 提取后的乌灵菌粉红外光吸收谱

图5 乌灵参提取液的液相色谱峰

4 乌灵参提取物有效成效分析

利用超声波细胞破碎仪对乌灵菌粉的醇分散悬浊液超声破碎30min后，用丙酮热抽提，然后用气相—质谱联用仪分析乌灵参提取液中的有效成分。从离子出峰时间来看，乌灵参提取液含量较多的有4种成分。出峰时间约是：9.5min、10.9min、12.1min、15.0min之间。图7至图9是相关成分经过和数据库比对得到的分析图谱。分析结果表明，提取物的成分比较复杂，一些单体拥有独特的2-甲酰基吡咯稠合吗啉环的三环骨架，均为螺环吡咯生物碱，这些化合物在天然产物中非常稀少。其它小分子单体有：5-羟基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氢色原酮(1)、5,7-二羟基-2-甲基-4-二氢色原酮(2)、5-羟基-2-甲基-4-二氢色原酮(3)、1-(2,6-二羟基苯)-3-羟基-丁酮(4)、5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(5)、麦角甾-7,22-二烯-3β-5α,6β-三醇(6)、大戟醇(7)、β-谷甾醇(8)、2-(4-羟基苯)-乙醇(9)、8-二羟基-3-甲基-3，4-二氢异香豆素等。另外，不能被提取的物质主要是多糖、腺苷、氨基酸、微量元素及蛋白质等。

图6 (A～J)乌灵参提取液各官能团质谱图

图7 提取液中主要的离子分布出峰时间

图8 14.007min离子峰对应的结构式

图9 16.531min离子峰对应的结构式

乌灵参主要成分为腺苷、氨基酸、多糖、微量元素及蛋白等[4,5]。特别是氨基酸的种类异常丰富，构成人体蛋白质主要的20种a-氨基酸，乌灵参就有17种；人体本身无法自身合成8种必需氨基酸，乌灵参就有7种，并含有大量的谷氨酸和较多的赖氨酸[1,6]。1993年，有学者从乌灵参中分离获得羧酸酯水解酶FE-Ⅰ、FE-Ⅱ、FE-Ⅲ和FE-Ⅳ。其中，FE-Ⅰ和FE-Ⅱ相对分子量约为78.5kDa，FE-Ⅲ和FE-Ⅳ约为78.5kDa，4种酶为同源二聚体，其亚基通过非共价键相连，酯酶活性较高[8]。

对于乌灵参所含的小分子单体成分研究，2001年，吴根福等从其深层发酵制品中获得能捕捉DPPH自由基活性成分,推断为5,8-二羟基-3-甲基-3,4-二氢异香豆素[9]。2008年，首次分离出5-羟基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氢色原酮、5,7-二羟基-2-甲基-4-二氢色原酮、5-羟基-2-甲基-4-二氢色原酮、大戟醇、1-(2,6-二羟基苯)-3-羟基-丁酮、β-谷甾醇、5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-二烯-3β-醇、麦角甾-7,22-二烯-3-β-5α,6β-三醇、2-(4-羟基苯)-乙醇等9个单体成分，其中化合物5-羟基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氢色原酮、5,7-二羟基-2-甲基-4-二氢色原酮为首次分离到的天然产物[22]。2015年，分离出2个新的化学单体xylapyrrosides A和B及2个已知化合物pollenopyrrosides A和B，均为螺环吡咯生物碱，2-甲酰基吡咯稠合吗啉环的三环骨架是其独特结构，在天然产物中极为少见[10]。此外，有研究报道显示乌灵参还含有8-二羟基-3-甲基-3,4-二氢异香豆素成分[11]。