散发性大肠癌中 hMLH1、hM SH2和 Rb的表达及意义△

西安医学院附属医院病理科(西安 710077)郑建云 赵喜凤 刘 冰 任天顺

大肠癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段、逐步演进的过程。错配修复基因(Mismatch repair gene,MM R)缺失是大肠癌发生的重要因素之一,并且有研究表明在散发性肿瘤中 MM R基因失活是由单个人类 mut-s同系物 1(Human mut-lhomologue 1,hM LH1)基因引起,它会引起基因更高突变率,从而使发生在某些原癌基因和抑癌基因中的突变得到快速积累,并最终影响到正常细胞的增殖调控,诱发癌变[1]。本研究采用免疫组化法检测 63例大肠癌组织、癌旁及正常组织中 MM R基因 hML H1、人类 mut-s同系物 2(Human mut-s homologue 2,hMSH2)和抑癌基因视网膜母细胞瘤基因蛋白(Retinoblastoma gene protein,Rb)的表达,旨在探讨它们在大肠癌形成过程中的变化规律及其与临床病理特征的相互关系。

资料与方法

1 临床资料 收集我院 2007年 1月至 2008年1月 63例手术切除的大肠癌标本。其中男 42例,女 21例;年龄 30～ 80岁 ,平均 62.59岁;结肠癌 33例,直肠癌 30例;高分化腺癌 12例,中分化腺癌 39例,低分化腺癌 12例;有淋巴结转移者 18例,无淋巴结转移者 45例;浸润范围:浆膜层 39例,肌层及黏膜下层 24例。同时取距癌灶 3 cm以外的癌旁组织、10 cm以外的正常组织。所有患者术前均未经放疗和化疗。所有标本经10%中性福尔马林液固定,石蜡包埋,连续切片,厚度4 μ m,HE染色和免疫组织化学染色。

2 HE染色 常规 HE染色,光镜下细胞形态学观察,以确定病理诊断及分级。

3 实验试剂 一抗均为即用型,hMLH1(克隆系:14)/hMSH2(克隆系:FE11)鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物有限公司,Rb(克隆系:1F8)鼠抗人单克隆抗体和即用型 Max-Vision检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

4 免疫组化方法 采用 Max Vision二步法,抗原修复用 EDTA(pH 8.0)高压锅热修复法,每批染色均设立已知阳性对照及用 PBS代替一抗的阴性对照,免疫组化染色具体步骤按试剂盒说明进行。

5 结果判定 hMLH1、hMSH2和 Rb阳性着色定位于细胞核,以细胞中相应部位出现棕黄色颗粒为阳性细胞。参照 Fromowitz方法[2],在高倍镜下对细胞内反应作如下评分:无着色为 0分,淡黄色为 1分,棕黄色为 2分,棕褐色为 3分,阳性范围:＜5%为 0分,5%～ 25%为 1分,26%～ 50%为 2分,51%～75%为3分,＞75%为 4分。两项结果相加 ＜2分为阴性,2～ 7分为阳性。

6 统计学处理 采用 SPSS16.0统计软件,两两间比较采用χ2检验。 hMLH1、hMSH2和 Rb在大肠癌中的表达相互间关系用非参数统计中 Spearman等级相关分析,以 P＜0.05为有显著性差异,P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 hM LH1在大肠正常组织、癌旁组织及大肠癌组织中的表达 见表 1。

2 hM LH1、hMSH2、 Rb的表达与大肠癌临床病理之间的关系 见表 2。

表1 hMLH1、hMSH2和 Rb在大肠正常组织、癌旁组织及大肠癌组织中的表达

hM LH1在大肠癌组织中阳性表达(81%)低于癌旁(85.7%)和正常组织(95.2%),两者与正常组有显著性差异(P＜0.05);hMSH2在大肠癌组织中阳性表达(52.4%)低于癌旁(66.7%)和正常组织(76.2%),两者与正常组有极显著性差异(P＜0.01);Rb在大肠癌组织中表达的阳性率(100%)高于癌旁(95.2%)和正常组织(47.6%),两者与正常组有极显著性差异(P＜0.01),并在中、低分化大肠癌组中阳性表达(100%)高于高分化大肠癌组(75%),两组有极显著性差异(P＜0.01)。

hM LH1在小于 60岁大肠癌组中阳性表达(100%)高于大于等于 60岁大肠癌组(75%),有淋巴结转移大肠癌组中阳性表达(50%)低于无淋巴结转移大肠癌组(93.3%),两组有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01),在不同性别,不同部位,不同分化程度及癌组织不同浸润范围大肠癌组织中表达无显著性差异(P＞0.05);hM SH2在小于 60岁大肠癌组中阳性表达(80%)高于大于等于 60岁大肠癌组(43.8%),在癌组织浸润肠壁浆膜层大肠癌组织中阳性表达(61.5%)高于浸润肌层大肠癌组(37.5%),两组有显著性差异(P＜0.05,P＜0.05),hM SH2在不同性别,不同部位,不同分化程度及有、无淋巴结转移大肠癌组织中表达无显著性差异(P＞ 0.05);Rb在不同性别,不同年龄,不同部位,不同浸润范围及有、无淋巴结转移大肠癌组织中表达无显著性差异(P＞0.05)。

表2 hMLH1、hMSH2和 Rb的表达与大肠癌临床病理特点间的关系

讨 论

大肠癌的病因除了与饮食、环境等因素有关外,研究表明 MM R基因突变和功能异常,是导致大肠癌发生的重要途径,但目前认为单独 MM R缺陷不足以引起肿瘤,MM R功能缺失导致一些抑癌基因突变率增加和突变的积累促进肿瘤的发生。

近年研究表明,MM R功能缺失引起部分散发性大肠癌的发生和发展[3]。Lindor检测 1114例散发性大肠癌 hMLH1和 hMSH2的表达[4],发现 228例出现hM LH1表达缺失,98例出现 hMSH2的表达缺失。而Leach等与以上研究结论不同[5],在散发性大肠癌中hM SH2蛋白高表达。本实验结果显示 hMSH2在大肠癌中的表达缺失率(47.62%)高于 hM LH1(19.05%),就基因表达缺失率而言,与上述研究结果有相符也有不相符的,但均提示在大肠癌中,hM LH1和 hMSH2存在一定缺失率。本研究还显示,hMLH1和hMSH2表达缺失率从正常组织、癌旁组织到癌组织逐渐升高,提示癌旁组织已经有 MMR的基因的突变或功能异常,MMR基因的突变,尤其是 hM LH1和 hM SH2的突变可能是大肠癌发生的早期事件之一。而且随着年龄的增长,hMLH1和 hM SH2表达缺失率逐渐升高,尤其是≥60岁年龄组缺失率明显高于 ＜60岁年龄组,两组有显著性差异。 Buermeyer等[6]在散发性大肠癌 hMLH1基因蛋白表达的免疫组化研究中发现,hM LH1表达缺失无一在 40岁以下人群中出现,而 90岁以上人群中29%出现 hMLH1表达缺失。本实验结果与上述研究大肠癌在高龄患者中常见的发病特点相吻合,在一定程度上也说明了高龄所造成的 hM LH1和 hMSH2表达缺失与大肠癌的发生具有一定的关系。我们还发现hMLH1的阳性表达在有淋巴结转移病例组显著降低,hMSH2的阳性表达在浸润范围广的病例中显著升高,虽然其机制还有待探讨,但可以推测 hMLH1和hM SH2的表达水平高低在判断大肠癌的浸润和转移方面具有一定的意义。

另有研究表明单独 MMR基因缺陷不足以引起肿瘤[7],这种缺陷主要通过两条途径促进肿瘤的发生和发展,其中最主要的途径是增加癌基因和抑癌基因的突变率,诱发癌变。 Rb是第一个被成功克隆的人抑癌基因。Rb基因的失活与视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌等许多肿瘤的发生密切相关,但 Rb基因在大肠癌发生、发展中的作用所知甚少,Gope(1990)首次报道[8],在大肠癌中 Rb基因过度表达,机制可能是 Rb基因发生了点突变,导致单个氨基酸的替代、置换,发生一种失活的 Rb蛋白,此蛋白不能对细胞增殖发挥调控作用,引起细胞异常大量增殖,Rb基因的结构改变与表达异常,可能是一些大肠癌发生发展中的重要环节。本研究结果显示 Rb在大肠正常组织、癌旁组织和癌组织中的阳性表达逐渐升高,而且差异显著,并且随着分化程度的降低阳性表达逐渐升高,与上述研究观点符合,可以推测 Rb阳性表达在大肠癌发生、发展和细胞增殖方面发挥重要作用。综上所述,散发性大肠癌的发生发展过程可能至少有两条途径,Rb过表达及 MM R基因缺失。采用免疫组化方法快速、简便、经济、有效,有利于临床推广。总之HMLH1、hMSH2和 Rb可以作为临床预测和判断大肠癌发生、发展有用的实验室指标。

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