小檗碱治疗腹泻的分子机制研究

第四军医大学西京消化病医院,肿瘤生物学国家重点实验室(西安 710032)

张永国 王 新 刘 霖 柴 娜 李泉江 吴开春

小檗碱(Berberine)是从黄连、黄柏等多种植物中提取(或人工合成)的生物碱,具有广泛的生物学作用。在中国,小檗碱用于治疗腹泻已有数千年的历史,但其作用机制尚未完全阐明。既往研究认为小檗碱主要通过抑菌作用来实现腹泻的治疗,但是仅仅抑菌作用并不能解释全部,特别是分泌性腹泻。在动物模型,小檗碱可以逆转霍乱毒素引起的腹泻[1];更有临床试验表明,在大肠杆菌和霍乱弧菌引起的腹泻中,小檗碱可以明显减少粪便排出的体积[2]。为进一步探讨小檗碱治疗腹泻的分子机制,本研究利用番泻苷 A诱导建立BALB/c小鼠的腹泻模型,并给予小檗碱治疗处理,采用半定量 RT-PCR和免疫组化的方法检测影响肠管水钠吸收的钠-氢交换体 1(NHE1)和钠-氢交换体 3(NHE3)的表达情况。

材料与方法

1 材料和试剂 BALB/c小鼠 (20～ 22g)由第四军医大学动物试验中心提供、盐酸小檗碱(Sigma)、番泻苷 A(成都曼斯特生物公司)、Trizol(Invitrogen)、First Strand cDNA Synthesis试剂盒 (Fermentas)、2× PCRMasterMix(北京天根)、NHE3羊抗多克隆抗体(SANT A CRUZ)、免疫组化试剂盒(北京中杉 )、DAB试剂盒(北京中杉)。

2 方 法

2.1 腹泻模型的建立及小檗碱治疗处理 取体重为 20～ 22g的雄性 BALB/c小鼠,随机分为空白对照组、腹泻组和处理组,每组 6只。空白对照组给予生理盐水灌胃、腹泻组每隔 12h给予 20mg/kg番泻苷 A灌胃;处理组在给予 20mg/kg番泻苷 A的同时,于30min后给予 80mg/kg小檗碱治疗处理。小鼠单笼单只饲养,笼底垫滤纸,计数 12h内每只小鼠的腹泻次数。连续处理 1周后,处死小鼠,取近端结肠用于半定量 PCR及免疫组织化学的检测。

2.2 总 RNA提取及 RT-PCR检测 分离小鼠近端结肠,刮取肠黏膜上皮细胞,采用异硫氰酸胍 /苯酚法提取总 RNA。取所提取的总 RNA 8 μ g,按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis试剂盒操作说明,逆转录合成 cDNA用于下一步的 PCR扩增反应。 PCR反应体系为 20 μ l:cDNA 1 μ l、上下游引物各1 μ l、2× MasterMix 10 μ l和 ddwater 7 μ l。 具体引物序列及反应条件,见附表。

附表 PCR引物序列、退火温度及循环数

2.3 免疫组化检测 分离小鼠近端结肠,于 4%多聚甲醛中固定 24h、石蜡包埋,4 μ m连续切片。切片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水,0.3%H2O2-甲醇溶液室温封闭内源性过氧化酶 30 min,滴加一抗 NHE3(1∶200)4℃过夜。复温 30min后滴加二抗-HRP多聚体于 37℃放置 30 min,DAB显色,苏木精复染,中性树胶封片。

结 果

1 腹泻模型的建立及小檗碱治疗效果的观察空白对照组所有小鼠均无腹泻症状出现,而腹泻组小鼠在给予 20mg/kg番泻苷 A灌胃 1～ 1.5h后,均出现明显的腹泻症状,如大便次数增多、糊状便及水样便,这些症状约持续 5～ 6h。小檗碱治疗处理组小鼠,腹泻症状得到很好的控制,很少出现糊状便及水样便。通过计数番泻苷 A灌胃后 12h内糊状便及水样便次数,可发现小檗碱处理组糊状便及水样便的次数明显少于腹泻组 (0.14± 0.05 VS 8.57± 0.1,P ＜ 0.05)。

2 小檗碱对 N HE1和 NHE3mRNA表达的影响RT-PCR结果 (见图 1)提示,NHE1和 NHE3mRNA在正常对照组、腹泻组及小檗碱处理组均有表达。其中腹泻组小鼠 NHE3m RNA的表达较正常对照组及小檗碱治疗处理组明显减少,其表达量约是正常对照组及小檗碱治疗处理组的三分之一,具有显著性差异(P＜0.05);但 N HE1mRNA的表达在三组间并无明显差异(P＞0.05)。这一结果提示小檗碱可以在 RNA水平上影响 NHE3而不是 NHE1的表达。

图1 RT-PCR检测小鼠模型中 N HE1和 N HE3mRN A的表达和相对表达量 (±s,n=6,*P＜0.05)

3 小檗碱对 NHE3蛋白表达的影响 免疫组化结果(见图 2)显示 NHE3蛋白主要表达于结肠上皮刷状缘。在正常小鼠结肠上皮 NHE3蛋白呈中度表达;而在番泻苷 A诱导的腹泻小鼠,NHE3的蛋白表达明显减少,呈少量表达乃至阴性表达;但接受小檗碱治疗处理的小鼠近端结肠上皮细胞 NHE3蛋白的表达重新上调,呈中度表达。这些结果提示在番泻苷 A诱导的小鼠腹泻模型中,小檗碱可以在蛋白水平上上调 NHE3的表达。

图2 免疫组织化学染色检测小鼠近端结肠 N HE3的表达(×400)

讨 论

小檗碱对霍乱毒素或致病性大肠杆菌引起的分泌性腹泻具有良好的疗效[2],提示小檗碱可能通过影响肠管分泌或吸收来发挥治疗腹泻的作用。

生理状态下,肠管上皮细胞存在大量离子通道及转运体,维持肠管的吸收和分泌处于平衡状态[3]。但当致泻物质,如细菌、病毒感染和毒素等作用于肠管时,这些离子通道及转运体的表达和(或)活性就会发生改变,从而打破吸收和分泌间的平衡,造成大量的水电解质丢失,严重者可导致患者的死亡。

钠-氢交换体(NHE)是一类跨膜蛋白家族,由 9个成员组成,其中 NHE1～4、NHE7和 NHE8已被证实表达于人肠道上皮,NHE通过介导 Na+与 H+的交换,参与机体对 NaCl的吸收、维持机体电解质平衡。NHE1广泛表达于肠管上皮细胞基底外侧膜,通过影响 Na+吸收,在生理状态下参与调节细胞内 pH值及细胞容积,病理状态下其表达下调与炎症性肠病时腹泻的发生密切相关[4]。 NHE3主要表达于结肠上皮细胞刷状缘,参与多种生理病理过程。生理情况下,NHE3主要通过介导肠腔内 Na+与肠上皮细胞内 H+的交换,促进肠管对钠离子吸收,进而形成渗透梯度,增加肠管对水的被动吸收[5]。病理状态下,NHE3与腹泻的发生发展密切相关,研究发现 NHE3基因敲除的小鼠,肠管对钠水的吸收明显减少并出现明显的腹泻[6],同时在炎症性肠病及霍乱毒素诱导的腹泻中,NHE3的表达和活性均受到明显的抑制[7,8]。

本研究利用番泻苷 A诱导建立 BALB/c小鼠的腹泻模型,并给予小檗碱治疗处理,检测了影响肠管钠水吸收的 NHE1和 NHE3的表达水平,结果发现,无论是在 RNA水平还是蛋白质水平,小檗碱治疗组小鼠近端结肠上皮细胞 NHE3的表达水平较腹泻组小鼠明显增高,而 NHE1的表达水平并无明显变化。

综上所述,在小鼠腹泻模型小檗碱可通过上调NHE3而不是 NHE1的表达,进而增强肠管对钠水的吸收,从而达到治疗腹泻的目的。但小檗碱具体通过何种机制上调 NHE3的表达尚需进一步的研究。

[1]Tai Y H,Feser JF,Marnane WG,et al.Antisecretory effects of berberine in rat ileum.Am J Physiol,1981,241(3):G253-258.

[2]Rabbani GH,Butler T,Knight J,et al.Randomized controlled trial of berberine sulfate therapy for diarrhea due to enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae.J Infect Dis,1987,155(5):979-984.

[3]Kunzelmann K,Mall M.Electrolyte transport in the mammalian colon: mechanismsand implicationsfor disease.Physiol Rev,2002,82(1):245-248.

[4]Kiela PR,Xu H,Ghishan FK. ApicalNa+/H+exchangers in the mammalian gastrointestinal tract.J Physiol Pharmacol,2006,57(Suppl 7):51-79.

[5]Alrefai WA, Scaglione-Sewell B, Tyagi S,et al.Differential regulation of the expression of Na(+ )/H(+ )exchanger isoform N HE3by PKC-alpha in Caco-2 cells.Am J Physiol Cell Physiol,2001,281(5):1551-1558.

[6]Schultheis PJ,Clarke LL,M eneton P,et al.Renal and intestinal absorptive defects in mice lacking the NHE3Na+/H+exchanger Renaland intestinal absorptive defects in mice lacking the NHE3Na+/H+exchanger.Nat Genet,1998,19(3):282-285.

[7]Sullivan S, Alex P, Dassopoulos T, et al.Downregulation of sodium transporters and NHERF proteins in IBD patients and mouse colitis models:Potential contributors to IBD-associated diarrhea.Inflamm Bowel Dis,2009,15(2):261-274.

[8]Subramanya SB,Rajendran VM,Srinivasan P,et al.Differential regulation of cholera toxin-inhibited Na-H exchange isoforms by butyrate in rat ileum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293(4):857-863.