趋化因子受体CCR5模拟肽生物学活性的初步研究

郭海萍 郑雪燕

广州医学院病原生物学与免疫学研室（510182）

趋化因子受体CCR5（chemokine receptor 5）为细胞膜蛋白，它有7个跨膜结构，属于G蛋白耦联受体超家族，CC亚族趋化因MIP-1α、MIP-1β以及RANTES是CCR5的主要天然配体[1,2]。CCR5被认为是诱导Th1细胞向炎症局部迁移的重要因子。目前CCR5已被证实对活化T细胞的游走起着非常重要的作用。CCR5的主要生物学功能是与相应的趋化因子结合来传递相应信号，使免疫活性细胞向趋化因子的来源部位募集、移动[3]。本研究通过对CCR5模拟短肽（HDTCSSHFPYSQ）对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的功能影响进行探讨，以期发现相应趋化因子受体拮抗药物的前体分子。

1 材料与方法

1.1 主要材料

MTS试剂盒（Cell T iter96®Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay）Promega公司产品。MIP-1α、MIP-1β及RANTES，英国Pepm Tech EC公司产品；RPML1640培养液和胎牛血清，Gibco公司；聚碳酸脂微孔滤膜（Polycarbonate membranes 10μm pore）和48孔标准趋化小室（Standard 48Well Chemotaxis Chamber）Neuro Probe Inc 公司。

1.2 CCR5模拟肽（HDTCSSHFPYSQ）的制备[4]

用噬菌体展示技术，以CCR5单克隆抗体作为筛选靶标，通过筛选噬菌体随机12肽库与CCR5单抗特异结合的肽段。经鉴定的30个阳性噬菌体克隆通过DNA测序，获得CCR5单抗模拟抗原表位的10个多肽序列。获得的核心序列HY-TC-SS-XX-P/FYS-X，与CCR5的一级序列ECL2具有一定的同源，选择出现频率最多（9次）的序列短肽（HDTCSSHFPYSQ），交由上海生工生物工程技术服务公司采用固相法合成模拟肽，合成肽用高效液相色谱HPLC纯化，并经质谱确认，短肽（HDTCSSHFPYSQ）溶解于DMSO中配成100mg/mL，稀释用pH 7.4的PBS溶液。

1.3 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离

取健康人新鲜血液（购于广州市金域体检中心），用PBS稀释血液1.5倍；将聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液放入离心管中，沿试管壁徐徐加入稀释血液至分层液面上1cm处 ，以2000r/min离心20min，离心后，在分层液与血浆交界处用毛细管吸取细胞层，获得单个核细胞（PBMCs）。37℃、5 %CO2、饱和湿度的条件下培养在含10%胎牛血清（FCS）、双抗青霉素100μg/mL和链霉素100μg/mL的RPMI 1640培养液中。

1.4 MTS法检测PBMCs增殖实验[5]

新鲜分离的PBMCs制成单细胞悬液，用RPMI 1640培养液调节细胞浓度为4×104个/mL，加入PHA 5μg/mL，每孔按0.1mL细胞悬液的量入至96孔细胞培养板，每组为3个重复孔，空白对照孔不加细胞。常规培养24h；试验组中每孔各加入0.05mL模拟肽样品，设不加入样品的阴性对照孔，培养48h；每孔各加入0.02mL MTS/PMS溶液，继续培养1～4h，测定OD490值。抑制率（CI）= （对照组OD490-样品组OD490）×100 %÷对照组OD490，计算值等于或超过30 %为抑制效果显著。

1.5 检测模拟肽对PBMCs对MIP-1α、RANTES及MIP-1β趋化活性的影响

48孔趋化小室上下室之间用Ⅳ型胶原包被的聚碳酸脂滤膜和乳胶隔垫隔开。下室每室加入29μL无血清RPML1640培养基，调整收获的PBMCs悬液，浓度为每毫升1×106 细胞，加细胞悬液至上室，每室45μL，3个重复样孔，孵育5h。取出微孔滤膜，刮膜器刮除干净滤膜上面的细胞，下层粘附的穿膜细胞以瑞氏染液固定、染色15min。显微镜下随机取上、下、左、右、中心5个视野，计数穿膜细胞数，取5个视野的总数表示单核细胞的趋化能力，平行实验进行2次。

2 结 果

2.1 模拟肽对人外周血单核细胞增殖的影响

采用不同浓度的模拟肽作用于PBMCs，如表1所示，当短肽的浓度为20mg/L时，对PHA诱导的PBMCs增殖表现了明显的抑制效应（P＜0.05），对PBMCs抑制率为30.2%；浓度为100mg/L时，对PBMCs抑制率达到了72.1%。

表1 MTS法检测短肽对PBMCs生长的影响

2.2 模拟肽对人外周血单核细胞趋化的影响

用模拟肽0.5mg/mL作用于PBMCs 4h，取下游离的聚碳酸脂膜，在显微镜下计数穿膜的细胞数，模拟肽组穿膜细胞数为（20±6）个，与对照组（18±5）相比，穿膜细胞数相差无几，说明短肽对PBMCs没有趋化作用（P＞0.05），而与RANTES组比较（73±10）穿膜细胞数相差明显（P＜0.05）；而预先经短肽处理2h的PBMCs （短肽+RANTES组） 其穿膜细胞数（26±9），则显著少于RANTES组（P＜0.05），说明短肽能够抑制PBMCs对RANTES的趋化效应。短肽预处理的短肽+ MIP-1α组和短肽+MIP-1β组分别与MIP-1α、MIP-1β组比较，结果发现该模拟肽不能影响MIP-1α和MIP-1β对外周血单核细胞的趋化作用（表2）。

表2 模拟肽对人外周血单核细胞趋化的影响

3 讨 论

RANTES和MIP-1α、MIP-1β等CC类趋化因子则主要趋化单核细胞和淋巴细胞。趋化因子通过和相应受体的高亲和结合产生生物学功能。由于G蛋白耦联受体有很高的易操作性，被认为是进行免疫学治疗阻断趋化性细胞因子在许多疾病中所起作用的可靠靶点。本研究对CCR5 模拟短肽（HDTCSSHFPYSQ）进行活性分析，我们采用MTS/PMS比色分析法，测定了活化后的增殖，发现该模拟肽能抑制PHA对PMBCs的活化增殖作用，20mg/mL时，抑制率达到30.2%；且能抑制PBMCs对RANTES的趋化作用，而该模拟肽不能影响MIP-1α和MIP-1β对外周血单核细胞的趋化作用。推测趋化因子受体CCR5模拟短肽（HDTCSSHFPYSQ） 可作为CCR5的拮抗剂为进一步研究打下基础。趋化性细胞因子受体选择性拮抗剂的发展，为进一步了解免疫系统的生物学机制提供了有力工具，也为我们治疗自身免疫性疾病、艾滋病等顽症提供了一种新的思路。

[1] Atchison REJ,Gosling FS.Multiple extracellular elements ofCCR5 and HIV-1 entry: Dissociation from response to chemokines[J].Science,1996,274(5294): 1924-1926.

[2] Agrawal L,VanHorn AZ,Edward A,et al.Specific inhibition of HIV-1 coreceptor activity by synthetic peptides corresponding to the predicted extracellular loops of CCR5[J].Blood,2004,103(4):1211-1217.

[3] Wolkowicz1 R,Gina CJ.A random peptide library fused to CCR5 for selection of mimetopes expressed on the mammalian cell surface via retroviral vectors[J].J Biol Chem,2005,280(15): 15195-15201.

[4] Smith GP ,Scott JK.Libraries of peptides and proteins displays on filamentous phage[J].Methods Enzymol,1993,217(4):228-257.

[5] Beatrice M,Antonella M. The novel proapoptotic activity of nonnatural enantiomer of Lentiginosine[J].Glycobiology,2010,20(5):500-506.