80 MeV/u C-12离子诱变选育PHB高产菌株

薛林贵 赵 旭 常思静 张 红 武振华 景春娥

1（兰州交通大学化学与生物工程学院 兰州 730070）

2（中国科学院近代物理研究所 兰州 730000）

聚β-羟基丁酸酯(PHB)是微生物细胞内积累的一种贮能物质，可由多种微生物在碳氮比失衡的情况下合成，它不仅具有类似于塑料性质，如可拉丝、成膜等，还具有生物相容性和生物降解性，在工业、农业、食品、环保、医药等领域有广泛应用前景[1]，但PHB的工业生产成本还远高于合成塑料。为此，国内外在PHB生产研究中做了大量工作，其中，通过诱变筛选PHB高产菌株，是非常有效的降低成本途径。常用的诱变方法主要有化学诱变和物理诱变，其中物理诱变的手段主要有紫外线、γ射线、X射线等低LET射线。重离子诱变是近年来发展起来的一种新方法。重离子属高LET辐射，其相对生物效应比低LET辐射大得多，能产生较高的突变率和较宽的变异谱，有利于选育生物新品种[2]。重离子辐照有可能使一些其它方法很难取得诱变效果的工业微生物，发生有经济意义的突变，为工业微生物诱变育种开辟新的途径[3]。本实验在兰州重离子加速器国家实验室的支持下，对PHB产生菌BacillusP-9进行不同辐照强度的诱变筛选研究，取得了十分有意义的结果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

芽孢杆菌(BacillusP-9)，由本校微生物工程研究室分离筛选获得。

1.1.2 仪器

落射荧光显微镜(宁波永新光学股份有限公司)，紫外分光光度仪 UV2100(尤尼柯仪器有限公司)，洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，高温灭菌器DSX-280B(上海中安医疗器械厂)等。

1.1.3 培养基

(1) 斜面培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油1.0，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

(2) 平板培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油10.0，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

(3) 基础发酵培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油 5.0，麦芽糖 5.0，pH 7.0，121℃灭菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 出发菌株生长曲线和PHB积累曲线

(1) 生长曲线测定：采用血球计数板法进行测定[4]；

(2) PHB含量测定：采用硫酸法测定。浓硫酸在100℃加热条件下会使PHB降解为巴豆酸，巴豆酸在235 nm紫外光谱区有吸收峰，通过紫外分光光度仪测定其吸收值，对照PHB标准曲线计算PHB含量。

1.2.2 菌悬液的制备

取两环培养24 h的斜面培养物，接入50 mL种子培养基中，在温度为29℃，转速为150 r/min的恒温振荡培养箱中培养，随时检测菌液浓度，待菌液浓度达到108个⁄mL时，取2 mL菌悬液装入Φ30 mm皿中备用。

1.2.3 重离子辐照

12C6+束由中国科学院近代物理研究所兰州重离子研究装置(HIRFL)产生，引出能量为80 MeV/u，LET为35.5 keV/mm，吸收剂量率约为1 Gy/min，用空气电离室监测剂量。样品更换及剂量数据获取由计算机控制，将装有菌悬液的Φ30 mm皿固定于特制转盘，用Φ40 mm重离子束斑垂直辐照，剂量分别为2.5、5、10、15、20 Gy，每个剂量做三个平行。

1.2.4 致死率测定

将处理过的菌悬液稀释至105倍，吸取0.2 mL涂平板，根据长出菌落的数量计算致死率。

1.2.5 诱变菌株初筛

将经过辐照处理的菌液，稀释至 105倍，吸取0.2 mL涂布在固体平板培养基上，使每个培养皿中的菌落数量约为50个，每个剂量涂布20个平皿，共计菌落数约为1000个，在29℃的培养箱中培养96 h备用。尼罗蓝是一种荧光染料，能特异性地对PHB进行荧光染色。用尼罗蓝溶液对细胞进行染色，尼罗蓝随之渗入细胞，与胞内的PHB颗粒结合，在荧光显微镜下可观察到细胞内含有许多发橙黄色光的颗粒，这种颗粒即PHB，其大小、多少及发光强弱代表细胞中PHB的含量[5]。挑取培养好的菌落制成尼罗蓝染色装片，在荧光显微镜下观察，选取PHB颗粒较大、数量较多、荧光较强的菌株进行复筛。

1.2.6 诱变菌株复筛

根据初筛结果，从固体平板上挑取需要的单菌落接入试管斜面培养基，待长满后，分别取两环接入50 mL液体种子培养基中，29℃摇瓶培养24 h，再以2%的接种量分别接入50 mL液体发酵培养基中，29℃摇瓶培养96 h。以细胞量和PHB含量为指标，原始菌株为对照，每12 h取样，测定细菌总量和PHB含量，绘制PHB含量曲线和生长曲线，选出PHB含量较高的突变株检测其遗传稳定性。

1.2.7 稳定性检测

筛选出的菌株连续传代 8次，测定每一代的PHB产量，比较其变化。

1.2.8 胞内PHB颗粒成分分析

FT-VERTEX 70的全数字化红外光谱仪[6]，德国Bruker公司；MERCURY 400 Plus的核磁共振仪[7]，美国Varian公司。

2 结果与分析

2.1 Bacillus P-9和G15菌生长和PHB积累规律

采用摇瓶发酵培养，每12 h取样，测定细胞量和PHB的含量，重复三次取平均值，制作BacillusP-9和G15菌的生长曲线与PHB积累曲线(图1)。结果表明，BacillusP-9菌株在接种后的前24 h处于延迟期，24 h以后进入对数生长期，同时开始积累PHB，在84 h细胞进入稳定生长期。稳定生长期时，细胞量和PHB积累均为最大，即BacillusP-9的PHB积累与菌体细胞的生长是同步的，属于一步发酵类型[8]。108 h时BacillusP-9的细胞量为 2.408×108个/mL，PHB产量为1.25 g/L。对G15菌的生长和PHB积累规律进行研究发现，与P-9菌株相比较，该菌株进入对数期的时间明显缩短，在培养72 h后即进入稳定期，PHB产量在培养60 h时达到最大，结果如图2所示。

图1 Bacillus P-9菌株(a)及其G15诱变菌(b)的生长和PHB积累曲线Fig.1 Cell growth (□) and PHB production (■) curves of Bacillus P-9 strain (a) and the G15 mutant (b).

2.2 重离子辐照对菌株的影响

辐照剂量和致死率的关系(表1)表明，重离子辐照对BacillusP-9的致死率随剂量增加，5 Gy以上剂量的致死率上升趋缓，20 Gy时致死率达97.44%。一般而言，致死率大于90%的照射剂量常用作诱变育种的参考剂量[9]。由表1，辐照剂量在10–20 Gy的范围内，BacillusP-9的致死率都大于90%，因此，突变菌株的筛选应主要在此照射剂量范围内。

表1 重离子辐照对Bacillus P-9菌株生长的影响Table 1 Effect of 80 MeV/u 12C6+ irradiation on growth of Bacillus P-9.

2.3 PHB高产菌株的筛选

2.3.1 PHB高产菌株的初筛

辐照菌液经平板涂布培养后，根据菌落的大小、形状进行初步筛选，选出菌株用尼罗蓝染色作荧光显微镜观察，与原始菌株对比作进一步筛选。约从5000株菌株中筛选出18株生长与PHB积累较好的菌株，正突变率为 0.36%。由选出菌株的荧光照片(图2)，筛选菌株的PHB颗粒明显多于出发菌株，颗粒的荧光强度也显著增强。选出菌株分别编号为G1、G2、G3、G4、…、G17、G18，接入斜面培养基培养，保存备用。

2.3.2 高产菌株的复筛

用摇瓶发酵法对原始菌株及上述 18株菌株进行培养，检测细胞内的PHB含量，最终筛选出编号为G15的菌株，其PHB产量最高，为2.93 g/L，这是出发菌株的1.5倍。

2.3.3 G15菌株的遗传稳定性

G15菌株进行稳定性研究表明(表2)，连续传代3次，其PHB积累量仍保持在94.2%。

图2 荧光显微镜示菌体及PHB积累(1000×)Fig.2 Observation of the PHB accumulation under fluorescence microscope (1000×).

表2 G15遗传稳定性Table 2 The genetic stability of G15.

2.4 PHB定性分析

2.4.1 红外光谱分析

G15菌株产生的 PHB样品的红外光谱与标准品的相似(图3)。样品在波数1723 cm处有一强烈峰值，此为羧酸中羰基(c=0)的吸收峰，3436 cm处存在 O-H 伸缩振动，2976 cm–1、2935 cm–1、2874 cm–1处存在-CH3、-CH2、-CH振动，这些都是 PHB的特征峰；此外在1058–1287 cm间存在大量C-O振动，为聚酯的特征峰，红外光谱测定结果说明G15菌株胞内积累的聚合物为PHB。

图3 红外吸收光谱Fig.3 Fourier transform infrared spectroscopy.

2.4.2 核磁共振检测

用核磁共振仪分析测定 PHB样品的碳链骨架结构，得到核磁共振碳谱，如图4(A)所示。4个主吸收峰分别位于 19.75、40.76、67.59、169.14，它们分别是由聚合物中的4种不同微电环境：-CH3、-CH2、-CH和C=O中的碳原子所产生的，77附近处的吸收峰是由溶剂CDCl3中的碳原子引起的，这一结果与 Jiang等[10]报道的基本一致。核磁共振氢谱如图4(B)所示，3个主吸收峰分别位于1.27、2.55和5.25，它们分别是由-CH3、-CH2和-CH中的氢原子震动引起的，其中-CH2中H周围的电子环境相对较为复杂，所以产生了较多的分裂，形成了多重峰(2.45、2.46、2.49、2.50、2.58、2.60、2.62、2.64)，7.26处的吸收峰由溶剂 CDC13产生，这一结果与Quillaguaman等[11]报道的基本一致。核磁共振检测结果进一步说明胞内聚合物为PHB。

图4 核磁共振谱图谱 A：13C，B：1HFig.4 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.

3 讨论

重离子辐照诱变技术应用于微生物，微生物的突变率较高，性能改良的幅度较大，而且应用方便、迅速、经济，所以被广泛用于对多种生物的改良和优化。随着重离子辐照诱变技术在优良性状微生物菌种选育中的不断应用，已取得了丰硕成果。颉红梅等[12]用40Ar离子辐照庆大霉素产生菌绛红小单孢菌，所得突变株的正变率为 69.1%。利用重离子辐照技术选育优良性状的之江菌素产生菌，获得的新菌株比出发菌株效价提高75.3%[13]。我们利用重离子辐照技术对菌株BacillusP-9进行诱变选育，结果表明，重离子辐照诱变显著提高了供试菌株PHB的产量，其重离子的最佳诱变剂量为15 Gy，致死率在90%左右时诱变效果最佳，重离子辐照诱变育种效果显著，具有广阔的发展应用前景。

进一步工作将用不同能量的离子束辐照处理菌株，研究其作用效果及机理，以指导设计最佳辐照诱变方案，达到更好的诱变效果，为进一步开展同类工作提供理论依据。本实验所用菌为芽胞杆菌属菌株，其产生的 PHB没有生物毒性[14]，可应用于医疗工业中，具有良好的研究和应用价值。期待进一步研究G15菌株的遗传稳定性及发酵条件，进行中试试验研究，尽快进入工业化生产阶段。

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4 杨 宇, 徐爱玲, 张燕飞, 等. 生命科学研究进展, 2006,12(4): 62–67 YANG Yu, XU Ailing, ZHANG Yanfei,et al. Life Sci Res,2006, 12(4): 62–67

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