基于纳米金、铁氰化镍纳米颗粒共修饰的电流型甲胎蛋白免疫传感器的研究

冉小琪，袁 若，柴雅琴，洪成林，刘凯歌

（西南大学化学化工学院,重庆市分析化学重点实验室，重庆400715）

0 引言

甲胎蛋白（α-1-fetoprotein，AFP）是由美国科学家Bergstrand和Czar于1956年在肝癌患者的血清中检测出的一种球蛋白[1]。AFP是胎儿早期由肝脏和卵黄囊产生的一种胚胎性蛋白，成人体内由肝细胞产生，正常成人体内含量极微。在大多数原发性肝癌或胚胎性癌患者体内，AFP的变化呈现出一定的规律，因此血清中AFP含量的检测对此类病症的诊断具有重要的意义[2～4]。目前基于抗体-抗原识别检测AFP的方法有很多种，应用较多的主要有酶联免疫吸附分析法（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）、间接血凝法、琼脂双扩散法等[5～6]。这些方法具有检测时间长，需要对抗原抗体进行标记，费用高，有放射性等缺点。电化学免疫传感器由于其灵敏度高、费用低、体积小、半自动化和便于携带等特点，而具有重要的理论研究意义和实践应用价值。

该文将anti-AFP固定在由纳米金/铁氰化镍纳米颗粒（NiHCFNPs）/纳米金修饰的玻碳电极表面，纳米金具有扩大电极比表面积和增大抗体固定量的功能，同时能提供和自然相似的微环境并保持固定分子的生物活性，使得修饰电极表面能吸附大量抗体并很好地保持其生物活性[7]。根据文献报导，在普鲁士蓝 （PB）类化合物中，NiHCFNPs展示了特殊的氧化还原特性，是一种良好的电活性物质，在设计传感器时将其加入，可以改善传感器的性能（灵敏度，检测限等）[8]。由于-NH2，-SH，-CN和纳米金之间存在强烈的化学作用[9～10]，NiHCFNPs和纳米金之间具有高的亲和性，因而可以直接将NiHCFNPs固定在沉积了纳米金的电极表面。NiHCFNPs具有大的比表面积，可以为固定第二层纳米金提供很好的生物兼容界面，再利用纳米金和-NH2间的化学吸附作用去固定anti-AFP。此外用这种方法形成的纳米金能提供一个稳定、粗糙和紧凑的表面，使之固定的抗体量增加。实验证明根据此原理制备的电极可以有效的测定AFP，并且检测限低，灵敏度高，线性范围宽，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器厂），pHS-3C型酸度计 （上海大普仪器有限公司），透射电镜（TECNAI 10，飞利浦，荷兰），CS501-SP 型超级数显恒温器 (重庆四达实验仪器厂)，KQ218超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），AB203-S电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

甲胎蛋白抗体和抗原（郑州赛博生物工程有限责任公司）；牛血清白蛋白(96%～99%)、氯金酸（HAuCl4）、 柠檬酸钠（Sigma 公司），K3Fe(CN)6和NiCl2·6H2O（四川化学试剂公司），其它试剂为分析纯试剂，实验用水为二次去离子水。0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）由Na2HPO4-KH2PO4配制，并由0.1 mol/L KCl做支持电解质。

1.2 铁氰化镍纳米颗粒(NiHCFNPs)的制备[11]

把 70mL 0.01 mol/L NiCl2溶液逐滴加到剧烈搅拌的含有 0.05 mol/L KCl的 70mL 0.05 mol/L K3Fe(CN)6溶液中。在NiCl2溶液滴加完后，混合溶液继续剧烈搅拌5 min。再将混合液立即高速离心并洗涤数次后转到真空干燥箱中，室温下过夜，最终得到黄色粉末NiHCFNPs。

1.3 免疫传感器的制备

首先，将玻碳电极（φ=4 mm）分别用 1.0、0.3 μm Al2O3粉抛光成镜面，每次抛光后都用二次去离子水冲洗干净。抛光后的电极依次用二次去离子水、1∶1硝酸、乙醇和二次去离子水超声清洗干净。

清洗后的玻碳电极立即浸入2 mg/mL的HAuCl4溶液中，并在恒定电位-0.2 V下沉积60 s。 用蒸馏水冲洗后，电极表面滴加 10 μL 0.05 mg/mL超声5 min后的NiHCFNPs混悬液，将电极转移到4℃下冰箱中放置3 h，取出用二次蒸馏水冲洗后，将电极再次浸入到2 mg/mL HAuCl4水溶液中恒定电位-0.2 V下沉积30 s并用二次蒸馏水冲洗干净。

将洗净的纳米金/NiHCFNPs纳米金修饰电极浸到anti-AFP中4℃12 h，最后将电极在室温下浸入2.5%的BSA溶液中1 h封闭非特异性吸附点位。修饰好的电极不用时悬置于PBS溶液上方4℃下储存。免疫传感器的逐步修饰过程如图1所示。

1.4 实验方法

实验测量以免疫电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极。所用的循环伏安法（CV），是一种有效、便捷的用来探测修饰电极表面特征的方法。在室温下的0.02 mol/L PBS(pH=7.0)里，在 0.0～0.8 V（对饱和甘汞电极）电位区间，扫速为50 mV/s条件下进行CV测试。

2 结果与讨论

2.1 NiHCFNPs的形态

NiHCFNPs的大小及形状直接影响着电极的性能，采用透射电镜TEM对其进行表征。图2展示了NiHCFNPs相对均一的微结构，平均尺寸为20 nm。

2.2 免疫传感器的电化学特征

图3为电极组装过程的循环伏安表征图。裸的玻碳电极由于缺少电活性物质，没有出现氧化还原峰（图3曲线a）；当在裸的玻碳电极上沉积一层纳米金后，由于纳米金可以促进电子传输，背景电流有所增加（图3曲线b）；在纳米金修饰的玻碳电极上自组装一层电活性物质NiHCFNPs后，出现一对明显的氧化还原峰，且峰电流非常大（图3曲线c）；在 NiHCFNPs/纳米金/GCE上再次沉积一层纳米金后，峰电流再次大幅增加（图3曲线d），原因是NiHCFNPs层结合的纳米金促进电子传递；将纳米金/NiHCFNPs/纳米金/GCE在anti-AFP中浸泡12 h后，峰电流明显下降（图3曲线e），证明anti-AFP已经结合到了电极上，生成的蛋白质大分子严重阻碍了电子传输到电极表面；用BSA封闭后，由于BSA阻碍电子传输，峰电流进一步下降（图3曲线f）。

图1 免疫传感器的组装过程Fig.1 Preparation process of the immunosensor

图2 NiHCFNPs的TEM表征图Fig.2 TEM image of NiHCFNPs

图3 电极制备过程中的循环伏安表征图(a)裸的玻碳电极;(b)在玻碳电极表面电沉积纳米金;(c)自组装NiHCFNPs层;(d)再沉积纳米金;(e)固定一层抗体膜;(f)用BSA封闭Fig.3 The diagram of the CVs of the stepwise

将免疫电极在0.02 mol/L PBS（pH=7.0）中用不同扫速进行循环伏安表征，随着扫描速度的不断增加，峰电流值也逐渐增大，且峰电流值与扫描速率的平方根（v1/2）成正比，说明该免疫电极受扩散控制。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 第一层纳米金沉积时间的优化

电化学还原氯金酸的时间与所形成的纳米金层的厚度、量有着直接的关系，影响着NiHCFNPs的固定并将进一步影响传感器的性能。还原时间越长，纳米金的量越多，但是如果还原时间超过一定值时，将可能导致纳米金层过厚，阻碍电子的传输并影响传感器的响应。在Fe(CN)64-/3-溶液（pH=7.0）中对第一层纳米金的还原时间进行优化。如图4所示，在60 s时，电流响应达到最大值。因此第一层纳米金的还原时间选作60 s。

图4 第一层纳米金在玻碳电极表面还原时间的影响Fig.4 The effect of electrochemical reduction time of the frist layer of nano-Au

2.3.2 第二层纳米金时间的优化

同样，第二层纳米金的还原时间也需要优化。在0.02 mol/L PBS（pH=7.0）中测定第二层纳米金还原时间对电流响应的影响。根据图5知，在还原时间为30 s的时候，峰电流最大，因此实验中采用30 s。

2.3.3 孵育时间的优化

抗体与抗原形成免疫复合物的反应平衡与孵育时间有着直接的关系。图6展示了当使用20.0 ng/mL AFP做孵育底液时孵育时间对传感器响应的影响。由图可知，传感器的响应电流随着孵育时间的增加而增加，到25 min之后，增加孵育时间，电流响应慢慢持平，表明免疫反应达到了平衡。故实验中选择孵育时间为25 min。

图5 第二层纳米金在玻碳电极表面还原时间的影响Fig.5 The effect of electrochemical reduction time of the second layer of nano-Au

2.3.4 工作底液酸度的优化

检测了pH从5.0到9.0范围内的0.02 mol/L PBS中该免疫传感器的电流响应变化情况（图7）。当pH值从5.0增加到7.0时,峰电流逐渐增加，pH从7.0到9.0增加时峰电流下降。实验结果展示在pH为7.0时，响应电流最大。因此实验中选择pH为7.0的磷酸缓冲液作为测试底液。

图6 孵育时间对免疫反应的影响Fig.6 The effect of incubation time on immunoreaction

2.4 免疫传感器的性能

在选定条件下，传感器在不同浓度的AFP标准溶液中孵育，图8展示了CV峰电流信号对AFP浓度的校准曲线，由图8可知峰电流与AFP浓度在1.0～10.0 ng/mL 和 10.0～200.0 ng/mL 两个浓度范围内成线性，两段线性的斜率分别为-5.878和 -0.215 1 μA/(ng/mL)， 相关系数分别为0.992 4和 0.992 1， 检出限为 0.2 ng/mL（S/N=3 时）。

图7 工作底液酸度对电极的影响Fig.7 The influence of pH of the PBS on the response of the immunosensor

图8 免疫传感器检测AFP的线性图Fig.8 Calibration plot of the immunosensor for detection of AFP

2.5 免疫传感器的稳定性和重复性

当传感器在PBS缓冲液中分别重复连续测定11次时，产生了3.3%相对标准偏差。实验中还研究了连续稳定性，当免疫传感器在PBS缓冲液中连续扫描50圈，产生了3.7%的相对标准偏差。

2.6 免疫传感器的选择性

将免疫传感器孵育在包含20.0 ng/mL AFP以及其它可能和AFP共存的物质中测定免疫传感器的选择性。该文研究了浓度分别为20.0 ng/mL的癌胚抗原，牛血清白蛋白，蛋氨酸，异亮氨酸，甘氨酸，L-半胱氨酸对AFP测定的干扰。其干扰可以用传感器在20.0 ng/mL AFP中含有干扰物质和不含干扰物质中孵育的电流响应值之比来评定。表1即为以上物质对AFP的干扰测定结果，实验表明，不存在明显干扰。

表1 免疫传感器的选择性Tab.1 Possible interferences tested with the immunosencor

3 结论

该实验利用纳米金和NiHCFNPs纳米颗粒固定anti-AFP，从而构建了一种新型的高灵敏度的电流型AFP免疫传感器。所研究的免疫传感器具有灵敏度高，制作简单，检测下限低，成本低，稳定性好的优点，有望用于AFP的医学研究和临床检验。

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