C反应蛋白基因多态性与原发性高血压病的关系

孔红 金玥雯 肖冰 姬开达 朱鼎良 高平进,2 张怡

(1.上海市高血压研究所,上海 200025;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科,上海 200025)

C反应蛋白(C reactive protein,CRP)是一种炎症和组织损伤的标志物。近年来众多研究[1-2]证实CRP参与了心血管疾病的发生,同时它也可作为一个有预测价值的心血管危险指标。CRP水平受年龄、吸烟、体质量指数等多种因素的影响。最近研究[3-4]显示CRP的遗传度在27%～40%,提示CRP基因的变异也可能会对CRP水平产生影响,其中CRP基因 rs1205、rs1130864、和 rs1800947多态已被较多研究[5-7]证实与CRP浓度有关。

高血压病患者的血管壁一般都有炎性反应,已知这种炎性反应参与了高血压病的发生、发展,但CRP是否可作为高血压病的危险因子尚无定论,CRP基因变异与原发性高血压病的相关性也鲜有报道。

本研究在原发性高血压病患者和正常血压者对照组进行CRP基因3个单核苷酸多态性(SNP)位点rs1205、rs1130864、和 rs1800947 的基因分型、单倍型分析及超敏C反应蛋白(hs-CRP)浓度的检测,以探讨CRP基因多态性与原发性高血压之间的关系。

1 资料与方法

1.1 对象和分组 共1384名受试者,均来自中国上海地区。其中712名为原发性高血压病患者(EH组),均为汉族,无亲缘关系;对照组(NT组)为672名年龄和性别与EH组匹配的血压正常者。高血压定义为收缩压(SBP)≥140 mmHg或舒张压(DBP)≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);排除继发性高血压病患者。NT组 SBP＜130 mmHg,DBP＜85 mmHg。测定所有对象的身高、体质量、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)及血尿素氮(BUN)。EH组中有554例检测了hs-CRP。本研究步骤得到上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会认可;受试者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指标及hs-CRP检测 所有入选者均于清晨空腹采肘静脉血,用全自动生化分析仪(200FR;T oshiba)测定 TC 、HDL-C、TG 、BUN 。 依据Friedewald公式计算得出低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。采用高敏免疫比浊法检测 hs-CRP(R&D公司试剂盒)。

1.2.2 血压测量 患者静坐10min以上,以水银柱血压计按标准方法检测右上肢肱动脉血压3次,取差值小于4 mmHg的2次血压的平均值。

1.2.3 DNA提取 抽取外周静脉血4mL,EDTA抗凝,红细胞清洗液2mL洗涤、离心 3次,取沉淀物,再加白细胞裂解液2mL、蛋白酶K 18μg,37℃水浴4 h,加酚、氯仿、乙醇提取白细胞基因组。标化DNA 浓度至5 ng◦μL-1。

1.2.4 SNP选择 选择 rs1205,rs1130864及rs180094基因位点,已经有报道上述3个位点和心血管疾病的有关联,且其值和CRP浓度有关联。所选择的SNP的详细信息列于表1。2min;95℃10min;92℃15 s,60℃1min,45个循环;4℃保存。等位基因的区分应用ABI7900高通量荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,美国)。

1.3 统计学方法 计量数据用均数±标准差表示。每组分别进行Hardy-Weinberg平衡检验,P＞0.05则符合Hardy-Weinberg平衡。对照组与EH组的等位基因和基因型频率比较采用在线的SHEsis软件完成(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php);Haploview 4.1(www.broad.mit.edu/mpg/haploview)分析各位点的连锁不平衡程度。多重检验应用错误检出率(FDR)方法进行,FDR q值的阈值为0.20。采用SPSS12.0软件t检验分析组间表型差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床资料比较 与NT相比,EH组 BMI、SBP、DBP、血清 TG 和 BUN 较高,而 HDL-C较低(P＜0.05)。两组年龄,性别,TC和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)比较,差异无统计学意义(t检验,均P＞0.05)(表2)。

表2 高血压组与对照组基本资料比较()

表2 高血压组与对照组基本资料比较()

注:BMI:体质量指数;SBP:收缩压;DBP:舒张压;TC:总胆固醇;TG:三酰甘油;BUN:尿素氮;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇

指标 EH组(n=712)N T组(n=672) P值性别(男/女) 402/310 349/323 0.094年龄(岁) 54.8±11.6 54.6±6.3 0.588 BMI(kg/m2) 26.2±3.4 23.0±2.6 ＜0.0001 SBP(mmHg) 145.3±20.0 114.4±12.0 ＜0.0001 DBP(mmHg) 89.2±12.9 75.9±7.6 ＜0.0001 TC(mmol◦L-1) 4.88±0.93 4.83±0.94 0.301 TG(mmol◦L-1) 2.26±1.55 1.36±0.79 ＜0.0001 LDL-C(mmol◦ L-1) 3.18±0.91 3.15±0.86 0.646 HDL-C(mmo◦L-1) 1.28±0.46 1.46±0.35 ＜0.0001

表1 3个入选的SNP的详细描述

1.2.5 SNP检测方法 采用TaqMan荧光探针定量PCR,由美国应用生物系统公司提供探针和引物。反应体系总体积5μL,其中 TaqMan通用PCR反应混合液(Master-Mix)2.4μL,探针 0.08μL,DNA 模板(5 ng◦μL-1)2.5μL。反应程序:50℃

2.2 单个SNP与EH的关系 两组3个SNP的基因型分布和等位基因的频率见表3。在EH组与对照组,3个SNP位点基因型分布和等位基因频率比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05)。

2.3 单倍型分析 rs1205 C/T,rs1130864 A/G这2个基因位点经过连锁不平衡分析,D'值＜0.85,进行单倍型分析。结果显示这2个SNP主要组成3种单倍型(表4),其中单倍型H1(C-A)在NT组频率显著高于EH组[优势比(OR)=0.617,95%可信区间(CI)0.429～0.887,P=0.009]。多重检验经过FDR校正后,相关性仍然显著(FDR q≤0.20)。

表3 两组3个SNP位点基因型分布和等位基因频率

表4 EH组和NT组单倍型的分布

2.4 EH组单倍型和表型的关系 在EH组中比较CA单倍型和其他单倍型的各种表型,差异均无统计学意义(P均＞0.05)(表5)

表5 EH组CA单倍型和其他单倍型的表型比较()

表5 EH组CA单倍型和其他单倍型的表型比较()

注:BMI:体质量指数;SBP:收缩压;DBP:舒张压;TC:总胆固醇;TG:三酰甘油;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;hs-CRP:超敏C反应蛋白

指标 CA单倍型(n=55)其他单倍型(n=499) P值性别(男/女) 33/22 315/184 0.046年龄(岁) 61.72±9.57 58.40±11.95 0.649 BMI(kg/m2) 26.18±3.82 26.10±3.25 0.871 SBP(mm Hg) 148.27±24.21145.93±19.46 0.410 DBP(mm Hg) 86.27±14.95 88.56±13.34 0.235 TC(mmol◦L-1) 5.11±0.92 4.92±0.90 0.146 TG(mmol◦ L-1) 1.93±1.08 2.27±1.65 0.133 LDL-C(mmol◦L-1) 3.01±0.67 2.81±0.72 0.056 hs-CRP(mg◦L-1) 1.13±1.25 1.25±1.72 0.618

3 讨 论

CRP于1930年被发现并命名[8],随后被证实为炎症的一种非特异但敏感的指标,在急性和慢性炎症中均参与作用。高血压病与动脉粥样硬化有着相似的动脉炎性病理改变,国内临床研究[9]提示CRP与血管内皮功能不全相关。2001年Bautista等[10]在对30例高血压病与CRP关系的横断面研究中发现,除外其他传统高血压病危险因素影响后,CRP水平与EH仍密切相关,并首次明确提出血清h多研究提示CRP浓度与高血压病发生有关[11-12],hs-CRP在高血压病多种危险因素中具有较高的敏感性与特异性[13]。

国外许多研究[5-7,14-17]报道CRP的rs1130864、rs1205、和rs1800947单个SNP或单倍型与CRP水平相关,但与冠心病的相关性尚有争议[15-16],与高血压病的相关性研究更少见报道。Komurcu-Bayrak等[18]对1138例土耳其人的研究发现,rs3091244、rs1800947、rs1130864、rs1205在女性均与 CRP水平相关,而在男性中 rs3091244和 rs1130864与CRP水平相关;4个SNP组成的单倍型CGCA和TGTG分别与女性和男性CRP水平及高血压病相关。Schumacher等[19]研究发现rs1130864、rs1800947和rs1205与健康人的CRP水平相关,但与反映动脉硬化的指标——脉搏波速度(PWV)无关。rs1800947及与 rs13411665和rs1130864组成的单倍型CCC在日本人群中与缺血性脑卒中相关[20]。本研究未发现CRP基因rs1205、rs1800947和rs1130864单个位点的基因型频率及等位基因频率在原发性高血压与正常血压对照组之间存在差异,但单倍型分析显示CA单倍型在高血压组和正常血压对照组之间的差异具有统计学意义。提示多位点的协同作用可能与高血压病的发生关联。高血压病的发生、发展就是一个多基因的参与的复杂过程,单一的基因位点多态性对原发性高血压的易感性未足以显示。本研究未观察到单倍型与hs-CRP的相关性,可能与研究位点较少、单倍型CA在人群中的分布较低、例数较少有关。同时CRP浓度与年龄、性别、吸烟、肥胖、糖尿病、生理活动和其他炎性因子有关,本研究尚未能排除肥胖、血糖、血脂等代谢因素对CRP的影响。

1 Pai JK,Pischon T,Ma J,et al.Inflammatory markers and the risk of coronary heart disease in men and women[J].N Engl J Med,2004,342:836-843.

2 Danesh J,Wheeler JG,Hirschfield GM,et al.C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease[J].N Engl J M ed,2004,350:1387-1397.

3 Pankow JS,Folsom AR,Cushman M,et al.Familial and genetic determinants of systemic markers of inflammation:the N HLBI family heart study[J].Atherosclerosis,2001,154:681-689.

4 Dupuis J,Larson MG,Vasan RS,et al.Genome scan of systemic biomarkers of vascular inflammation in the Framingham Heart Study:evidence for susceptibility loci on 1q[J].A therosclerosis,2005,182:307-314.

5 Russell AI,Cunninghame G DS,Shepherd C,et al.Polymorphism at the C-reactive protein locus influences gene expression and predisposes to systemic lupus ery thematosus[J].Hum Mol Genet,2004,13:137-147.

6 Suk HJ,Ridker PM,Cook N R,et al.Relation of polymorphism within the C-reactive protein gene and plasma CRP levels[J].A therosclerosis,2005,178:139-145.

7 Zee RY,Ridker PM.Polymorphism in the human C-reactive protein(CRP)gene,plasma concentrations of CRP,and the risk of future arterial thrombosis[J].Atherosclerosis,2002,162:217-219.

8 Tillett WS,Francis T Jr.Serological reactive in pneumonia with a non protein insomatic fraction of pneumococcus[J].J Exp Med,1930,52:561.

9 孙韬,张象贤,施海明.超敏C-反应蛋白与血管内皮功能不全[J].中国临床医学,2006,13(1):10-11.

10 Bautista LE,López-Jaramillo P,Vera LM,et al.Is C-reactive protein an independent risk factor fo ressential hypertension[J].J Hy pertens,2001,19:857.

11 Diaz JJ,Arguelles J,Malaga I,et al.C-reactive protein is elevated in the offspring of parents with essential hypertension[J].Arch Dis Child,2007,92:304-308.

12 Keenig W,Khuseyinova N,Baumert J,et al.Prospective study of hig h-sensitivity C-reactive protein as a determinant of mortality:results from the MONICA/KO RA Augsburg Cohort Study,1984-1998[J].Clin Chem,2008,54:335-342.

13 李艳秀,张怡,牛文全,等.高敏 C反应蛋白在高血压多种危险因素中敏感性与特异性最高[J].中华高血压杂志,2009,17:33-36.

14 Suk Danik j,Chasman DI,Cannon CP,et al.Influence of genetic variation in the C-reactive protein gene on the inflammatory response during and after acute coronary ischemia[J].Ann Hum Genet,2006,70:705-716.

15 Kardy s I,de Maat MP,Uitterlinden AG,et al.C-reactive protein gene haploty pes and risk of coronary heart disease:the Rotterdam Study[J].Eur Heart J,2006,27:1331-1337.

16 Miller DT,Zee RY,Suk Danik J,et al.Association of common CRP gene variants with CRP levels and cardiovascular events[J].Ann Hum Genet,2005,69:623-638.

17 Pai JK,Mukamal KJ,Rexrode KM,et al.C-reactive protein gene polymorphisms,CRP levels,and risk of incident coronary heart disease in two nested case-control studies[J].Plos One,2008,3:1395.

18 Komurcu-Bayrak E,Erginel-Unaltuna N,Onat A,et al.Association of C-reactive protein(CRP)gene allelic variants with serum CRP levels and hypertension in Turkish adults[J].Atherosclerosis,2009,206:474-479.

19 Schumacher W,Cockcroft J,Timpson NJ,et al.Association between C-reactive protein genotype,circulating levels,and aortic pulse wave velocity[J].Hypertension,2009,53:150-157.

20 Morita A,Nakayama T,Soma M.A ssociation study between C-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subjects[J].Am J Hypertens,2006,19:593-600.