人β淀粉样蛋白1-42在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定*

熊坤林,杨清武,熊任平

(第三军医大学大坪医院:1.放射科;2.神经内科;3.野战外科研究所第六研究室,重庆400042)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是发生于老年和老年前期的中枢神经系统变性疾病,临床上表现为隐袭起病、进行性发展的记忆减退、认知、语言障碍及人格改变等。其特征性病理学改变是大脑皮层和皮层下结构细胞内神经元纤维缠结(neuofibrillary tangle,NFT)、细胞外大量老年斑(senile plaque,SP)形成及神经元缺失等[1-3]。其已成为继心脏病、癌症和中风之后第4位死因。神经毒性β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)在脑内的聚集和异常沉积是AD发病的关键环节。AD医学影像学诊断尚无突破性进展,为研制一种敏感且具有高血脑屏障的分子特异性探针——腐胺-钆-β淀粉样蛋白(putrescine-Gadolinium-amylor-β peptide,PUT-GD-Aβ),该 分子探针既可特异性标记AD的 β淀粉样斑块(β-amyloid plaques),也因为金属钆而产生M RI下可见的对比增强,可用于AD的影像诊断和鉴别诊断[4]。本研究拟在大肠杆菌中高效表达并纯化人源性β淀粉样蛋白 1-42(Aβ1-42),为该标记探针的制备提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株 表达质粒pET-28a(+)购自美国Novagen公司,大肠埃希菌BL21(DE3)株由本室保存。

1.2 主要试剂及引物合成、测序 高保真KOD-plus Taq酶、限制性内切酶 NcoⅠ、Bam HⅠ、Mag Extractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit试剂盒购自日本Toyobo公司,T4 DNA连接酶购自上海生物工程公司,DNA Marker及蛋白Marker购自北京鼎国生物公司,PVDF膜购自美国Roche公司,Aβ1-42蛋白单克隆抗体6E10(针对Aβ1-17)购自美国Calbiochem公司,荧光标记羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司,DNA片段和引物合成及DNA测序由上海生工提供服务。

1.3 人源性Aβ1-42蛋白编码区 DNA片段的获取 Aβ1-42蛋白为酶降解的β淀粉样前体蛋白(homo sapiens amyloid precursor protein,APP)的616-657位氨基酸序列。根据该段蛋白的编码区序列(Gen Bank中的登录号为NM_001136130)设计3条DNA片段,经退火延伸后形成Aβ1-42蛋白的编码双链DNA 序列。 片段1:5′-gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa tt-3′(正链),片段 2:5′-cct ttg ttt gaa ccc aca tct tct gca aag aac acc aat ttt tga tga tga act-3′(负链),片段3:5′-cgc tat gac aac acc gcc cac cat gag tcc aat gat tgc acc ttt gtt tga acc cac-3′(负链),3条DNA片段的退火反应体系为片段 1、2、3(10mmol/L TE 溶解,终浓度为 10μ mol/L)各8μ L,10×PCR Buffer 2.5μ L,MgCl22.0μ L,dN TPs 2.0μ L,KOD-plus Taq酶 1.0μ L,ddH2O 18.5μ L。热循环参数为 94℃、2min;(94℃、20s,55℃、20s,72℃、30s)×20循环;72℃、3min。所获产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,稀释后用作下一步PCR模板,扩增获得目的片段。扩增引物为上游引物:5′-tat acc atg gat gca gaa ttc cga cat ga-3′(下划线部分为 NcoⅠ位点,加黑部分为起始密码),下游引物:5′-ttc gga tcctta cgc tat gac aac acc gcc-3′(下划线部分为Bam HI位点,加黑部分为终止密码)。PCR反应体系(25.0μ L)为退火的模板 DNA回收物(1∶100稀释)1.0μ L,10×PCR Buffer 2.5μ L,M gCl22.0 μ L,dNTPs 2.0μ L,KOD-plus Taq 酶 0.2μ L,上游引物(10μ M)1.0μ L,下游引物(10μ M)1.0μ L,ddH2O 15.3μ L 。 热循环参数为 94℃、2min;(94℃、20s,55℃、20s,72℃、30s)×32 循环;72℃、3min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,回收目的片段,作下一步的酶切和连接反应。

1.4 重组质粒pET-28a-Aβ1-42的构建

1.4.1 NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切反应 将上一步骤中所回收纯化Aβ 1-42的 PCR产物和 pET-28a(+)质粒作 NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切反应,反应体系见表1。置 37℃、3h反应。酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,回收目的片段,作下一步的连接反应。

表1 NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切反应体系(μ L)

1.4.2 连接反应 反应体系为pET-28a(+)/NcoⅠ、Bam HⅠ双酶切产物(约 1μ g/μ L)3.0μ L,Aβ1-42/Nco Ⅰ 、Bam H Ⅰ双酶切产物(约 1μ g/μ L)2.0μ L,Ligation high 反应液 5.0μ L,总体系10.0μ L。置 16℃、1h反应。连接产物直接转化大肠埃希菌BL21感受态。

1.5 Aβ1-42蛋白在大肠杆菌中的表达 用常规CaCl2法制备BL21感受态。取10μ L上一步骤的连接产物常规转化到100μ L BL21感受态细胞中,将转化产物与IPTG和X-gal涂布于LB(Kanr)平板上,37℃过夜孵育。挑选阳性克隆,提取重组质粒。阳性重组质粒 pET-28a(+)-Aβ1-42作 NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切鉴定后,再作DNA测序鉴定。挑选重组质粒序列完全正确的阳性重组菌,于 Kanr的LB液体中,37℃、160rpm离心,培养至菌液OD600达0.6～0.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达 6h,培养物离心,沉淀用 SDSPAGE上样缓冲液裂解,作 15%T ricine-SDS-PAGE电泳,凝胶扫描成像。对照菌为不含插入基因的质粒pET-28a(+)转化BL21菌。

1.6 重组蛋白表达形式的鉴定 收集诱导表达后菌体,PBS混悬,超声破菌,15 000g离心10min,分别收集上清液和沉淀。裂菌液上清液及沉淀溶解液取样进行SDS-PAGE电泳分析。

1.7 重组表达蛋白的纯化 表达蛋白的C-端含6×His标签,故采用日本 Toyobo生物公司的MagExtractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit试剂盒进行纯化。参照试剂盒说明书中可溶性蛋白和包涵体不溶性蛋白的纯化方法分别进行。所获产物作15%T ricine-SDS-PAGE电泳。

1.8 表达蛋白的Western blot鉴定 纯化蛋白作SDS-PAGE电泳后,转印PVDF膜,按照参考文献[5]的方法进行。一抗和二抗的结合和反应参照试剂说明书进行。

2 结 果

2.1 Aβ1-42蛋白编码片段的获得 通过3个合成单链DNA片段的退火,获得126bp的 Aβ1-42蛋白编码序列,进一步经PCR扩增,获得两端分别含NcoⅠ、Bam HⅠ酶切位点的DNA片段,同时加入起始密码和终止密码,琼脂糖凝胶电泳见图1。

图1 Aβ1-42蛋白编码片段 PCR产物电泳图

图2 重组质粒pET28a(+)-Aβ1-42经NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切后电泳图

2.2 pET28 a(+)-Aβ1-42重组质粒双酶切及核苷酸测序鉴定 将Aβ 1-42蛋白编码序列片段PCR产物作NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切后回收纯化,与经同样双酶切的pET28a(+)质粒回收产物连接,连接产物转化BL21(DE3)细菌感受态细胞,挑取转化平板上的单个菌落,提取重组质粒pET28a(+)-Aβ1-42,采用NcoⅠ/Bam HⅠ双酶切鉴定,酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,见图2。重组质粒中可切出预期大小的片段(Aβ1-42蛋白编码序列理论值约为130bp)。进一步对重组质粒进行DNA测序,结果表明,重组质粒的序列和阅读框均完全正确。测序结果见插页Ⅰ彩图3。

2.3 pET28(a)-Aβ1-42表达形式的判定及表达蛋白的纯化将筛选到的阳性pET28(a)-Aβ1-42工程菌加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况。可见明显的约4.5×103表达蛋白条带,与理论预期值相符。进一步采用MagExtractor-His-tag Fusion Protein Purification Kit进行纯化后得到高纯度目的蛋白,经凝胶电泳后扫描,其纯度为55%,为进一步的GST纯化和 Thrombin切出成熟的 Aβ1-42表达蛋白提供了基础,见图3。

图3 exCAR表达蛋白的纯化结果

2.5 纯化表达蛋白的Western blot鉴定 纯化表达蛋白的Western blot结果见图4。在约6×103位置出现明显特异性阳性条带,说明表达蛋白确为人源性Aβ1-42蛋白。

图4 纯化表达蛋白的Western blot鉴定

3 讨 论

AD是引起痴呆最常见的疾病之一,大概占痴呆病因的50%～60%,在西方发达国家AD在60～64岁年龄组的发病率不到1%,但在85岁及其以上的人群中发病率呈指数级增长(24%～33%);在发展中国家AD的发病率有所降低,但却有60%AD患者是分布在发展中国家的,目前AD成为威胁公众健康的主要疾病,2001年全世界AD患者2 400万,随着人类寿命的延长,到2040年估计将有8 100万AD患者[1-2]。其已成为继心脏病、癌症和中风之后第4位死因。

AD的诊断除常规行为学检查外,辅助诊断方法有神经心理学检查、生化指标检查、电生理学检查、神经影像学检查等,而其中神经影像学检查对病情和病程的判断和预后最为直接和重要[6]。由于诊断和鉴别诊断困难,医学影像学的AD研究很受限制,目前临床上对于AD的影像学诊断多停留在脑容量测量(估计脑萎缩程度)或通过MR频谱分析成像(M RS)对物质新陈代谢率及葡萄糖代谢等间接检测水平上[7-8]。近年来随着分子影像学的发展及MR仪器分辨率的不断提高,特别是MR显微成像技术的发展,为AD的明确诊断及病变过程的追踪及定量监测、治疗效果的评判开辟了一条崭新的道路。

本研究拟研制一种敏感的分子特异性探针(PUT-GDAβ),其可以特异性标记AD的β淀粉样斑块并因为其与金属钆的连接而产生M RI下可见的对比增强,其研究进展将对未来AD的诊断及治疗产生直接深刻的影响[4]。首先,该标记法可用于AD疾病的早期发现和明确诊断;其次,可用于对疾病的发展过程进行追踪,并且对于常用的抑制Aβ生成或减少淀粉负担的治疗措施的疗效进行定量监测评价。这种方法可以解决以往疗效评估无明确定量指标、疗效观察所需时间长(往往需要几个月)等难题。

Aβ是一系列含39～43个氨基酸的肽,为 APP的水解产物。APP在β分泌酶作用下生成APP-C99,后者在γ分泌酶复合体作用下形成长度不等的 Aβ片段,包括 Aβ 42、Aβ43和Aβ40[9]。人Aβ1-42蛋白为酶降解的APP的616～657位氨基酸序列,其全部氨基酸序列为 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA。理论相对分子质量约为4.5×103,人源性β淀粉样A4前体蛋白序列在GenBank中的登录号为NM_001136130。通常在研究工作中,往往采用多肽合成的方法获得Aβ 1-42肽,但这种方法仍存在一些问题,如价格昂贵、难以保存为 Aβ 1-42单体形式、Aβ1-42在多肽合成仪上属于难合成肽等。因此,本研究采用大肠杆菌表达,通过3条DNA片段合成获得 Aβ 1-42蛋白编码区片段,连接至表达质粒pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21株中获得了表达,并通过纯化蛋白的Western blot进一步鉴定了该表达蛋白,但该蛋白的表达形式为包涵体。

通常来说,绝大多数外源性蛋白在大肠杆菌中会形成包涵体,其形成的原因还不甚明了,但是普遍认为是由于重组蛋白在宿主菌中表达时,缺乏某些蛋白质折叠过程中所需要的酶或分子伴侣等,所以无法形成正确的次级键等原因造成的。当外源蛋白表达量过高、重组蛋白含硫氨基酸过高、重组蛋白的等电点与胞内pH接近及重组蛋白为异源性蛋白时,更容易形成包涵体[10]。本研究曾采用一些措施,一是降低诱导剂浓度,如将IPTG终浓度降至0.1mmol/L;二是降低诱导时工程菌的培养温度,如在25℃条件下进行诱导,以降低工程菌合成外源性蛋白的速度,以期获得可溶性的表达蛋白,但均未成功。这可能与表达蛋白的特性有关[5]。由于pET表达系统的宿主细胞为改造后λ噬菌体CE6感染的大肠杆菌BL21溶源菌株,该菌株的基因组中整合有laco调控的T7 RNA聚合酶基因,这种严格的双重调控可以确保表达载体中目的基因的严格诱导性表达,有效避免目的蛋白质对宿主细胞的毒性作用而引起的质粒不稳定性[11]。

本研究所获得的基因工程化Aβ1-42蛋白,N-端含载体序列编码的6×His和GST标签,采用镍株法一步纯化,获得的蛋白分子质量约为6×103,与理论相对分子质量相符。本研究为下一步采用GST标签纯化和 Thrombin切出4.5×103的Aβ1-42蛋白及PUT-GD-Aβ的制备提供了物质基础。

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