76例食管胃交界腺癌肿瘤相关成纤维细胞免疫组化观察*

周海英,吴爱萍,刘 岩,陈银苹,郑素琴,王文雅

(1.河北医科大学附属唐山工人医院胸外科;2.华北煤炭医学院病理教研室,唐山;3.华北煤炭医学院流行病学与卫生统计学教研室,唐山063000)

侵袭和转移是恶性肿瘤最为明显的生物学特性,既与肿瘤细胞自身特性相关,亦受临近肿瘤宿主成分的影响,因此,有学者提出了肿瘤-宿主界面微环境这一概念,即变异上皮与其临近间质所构成的微生态环境[1]。肿瘤相关成纤维细胞(tumorassociated fibroblasts,TAFs)是此界面体系中最重要的宿主细胞之一,其所分泌的成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肝细胞生长因子(HGF)等在恶性肿瘤发生、发展中起重要作用[2]。食管胃交界腺癌是指横跨食管和胃交界的腺癌,过去多笼统称为胃贲门腺癌。但无论从病理上还是临床特征上,贲门癌均与远端胃癌有明显的不同,却与食管远端腺癌有许多相似之处,因此,学术界都倾向将食管胃交界腺癌列为一独立类型的肿瘤,并按食管癌TNM分期标准进行分期[3-4]。本课题通过研究FAP、HGF的表达,分析食管胃交界腺癌中 TAFs及其与临床病理参数的关系。

1 临床资料

1.1 一般资料与标本采集 选择本院2006～2009年原发性食管胃交界腺癌手术切除患者标本76例,其中男51例,女25例;年龄40～76岁,中位 59岁。所有患者术前均未经化疗和放疗。另通过胃溃疡行胃大部切除术获取正常胃黏膜标本6例,慢性萎缩性胃炎胃黏膜标本6例。

1.2 实验方法

1.2.1 手术标本行常规甲醛固定,24h内取材,石蜡包埋后行4μ m厚连续切片,分别进行常规HE染色和免疫组化染色(SP法)。

1.2.2 免疫组化试剂为鼠抗人FAP单克隆抗体(Alexis公司)、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(ZYMED公司)、鼠抗人HGF单克隆抗体(Alexis公司)、免疫组化即用型SP试剂盒(福建迈新生物技术开发公司)等。免疫组化染色过程参照试剂盒说明书操作。

1.2.3 以分别表达FAP、HGF、Vimentin的乳腺癌标本为各自阳性对照;以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 由2位资深病理医师独立观察每张切片。结合阳性片中典型阳性细胞的着色特征并排除边缘效应、刀痕等非特异性染色干扰因素的影响,将胞膜、胞浆中出现棕黄色着色的细胞判定为FAP/HGF阳性显色细胞;将胞浆中出现棕黄色颗粒的细胞判定为Vimentin阳性显色细胞。结合细胞形态、位置进行分析,判定Vimentin阳性显色细胞为成纤维细胞,Vimentin与FAP同时阳性者为TAF。FAP、HGF根据阳性细胞染色程度及染色细胞百分率进行评分。选择10个典型视野(×400),每个视野内随机计数50个成纤维细胞,共500个,阳性细胞百分率用分值表示,不表达为0分,＜10%为1分,10%～50%为2分,＞50%为3分;基本不着色者为0分,着色淡者为1分,着色深者为2分;每个视野内着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘为该视野的最后得分,每张片子10个视野的平均分值为该标本的最后染色分值。参照Hasebe等[5]和郑华等[6]的标准,将最后平均染色分值小于1者记为染色阴性标本,＞1者记为染色阳性标本。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件包进行分析。食管胃交界腺癌组与对照组、食管胃交界腺癌组各病理分级之间FAP(HGF)染色分值比较采用秩和检验;FAP、HGF染色阳性标本百分率比较采用卡方检验;FAP、HGF染色分值与食管胃交界腺癌病理分级是否相关采用Spearman′s分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 正常胃黏膜及慢性萎缩性胃炎组 黏膜上皮和间质组织内均未见FAP或HGF阳性细胞,在间质中可见较多Vimentin阳性细胞,尤其是在远离上皮的间质中。

2.2 食管胃交界腺癌组 在间质中可见FAP、HGF阳性细胞,且染色阳性标本数目与肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移数目等呈正相关,且各组间阳性标本数比较,差异有统计学意义。FAP、HGF两者之间呈正相关,其有效度及信度差异无统计学意义(表1)。

表1 食管胃交界腺癌中FAP、HGF的表达(n)

3 讨 论

TAFs是肿瘤-宿主界面体系中最重要的宿主细胞,表达多种细胞因子、蛋白酶、黏附分子等,与肿瘤细胞相互作用,不同程度增加肿瘤细胞的恶性表型,对肿瘤发生、生长、血管形成、浸润与转移有重要作用,并具有器官特异性。

FAP是TAFs的标志性产物之一,属于丝氨酸蛋白酶类,其选择性表达于上皮性肿瘤间质及伤口愈合处,具有分解明胶和Ⅰ型胶原的活性以及类似二肽基肽酶的活性[7]。FAP主要通过下列方式对肿瘤-宿主界面微环境中各组成成分产生影响:(1)通过直接溶解与其相邻的细胞外基质或激活另外一种蛋白酶而间接溶解基质,促进癌细胞的侵袭,并参与基质的重建;(2)解离与基质蛋白结合的生长因子,使之发挥促癌细胞生长的作用;(3)促进肿瘤微血管生成,从而有利于癌细胞的生长、侵袭[8-9]。

HGF是TAFs分泌的一种血源性生长因子,是近年来研究较多的调节肿瘤细胞浸润、转移的关键细胞因子。在促进细胞分裂、增殖、分化、运动及形态发生、血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡等方面发挥重要的生物学功能[10]。HGF在肿瘤侵袭、转移中的作用机制包括以下几个方面:(1)促进肿瘤细胞迁移,增加瘤细胞侵袭性[11];(2)诱发血管生成,HGF可通过磷脂酰肌醇3激酶通路诱导血管内皮生长因子的分泌和表达,从而间接促进血管生成[12];(3)促进细胞增殖。

本实验通过对FAP、HGF染色阳性细胞的形态、位置进行分析,初步确定其属于成纤维细胞类型。为进一步明确细胞类型,本实验同时进行了波形蛋白的免疫组化染色,结果显示,对应于FAP阳性染色的细胞区域,波形蛋白的表达也呈阳性,说明其属于成纤维细胞类型。免疫组化结果显示,FAP及HGF在无病变胃黏膜、慢性萎缩性胃炎间质中不表达,在食管胃交界腺癌间质中表达阳性,提示FAP及HGF可作为判定胃黏膜良恶性病变的指标之一。另外在食管胃交界腺癌中,FAP、HGF染色阳性标本数目与肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移数目等呈正相关,提示 FAP、HGF的表达与食管胃交界腺癌的恶性程度及侵袭程度有密切关系,FAP及HGF表达明显则肿瘤向深度侵袭的可能性加大,淋巴结转移的可能性加大。随着癌细胞的不断浸润扩展,间质中更多的成纤维细胞转化为TAFs,分泌更多的FAP及HGF发挥生物学效应,造成癌细胞进一步侵袭、转移。抑制FAP及HGF的活性可能抑制肿瘤的侵袭和转移。

综上所述,食管胃交界腺癌中TAFs的FAP、HGF表达增加,且与肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移数目等临床病理参数相关。因此,推测TAFs可能通过其分泌的各种蛋白及生长因子等,对食管胃交界腺癌的浸润、转移等起着较重要的作用。

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