人TLR1胞外段的克隆及测序分析*

黄 黎,周丽珍,年四季,刘佳佳,袁 青△

(泸州医学院:1.基础部;2.附属口腔医院,四川泸州646000)

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为细胞表面模式识别受体,可识别多种病原相关分子模式(PAMPs)[1],经髓样分化蛋白88(MyD88)依赖和非依赖的信号转导途径介导机体的天然免疫,同时在机体适应性免疫中也发挥重要作用[2-6]。目前,人 TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9等受体相继被克隆、表达,并用于对病原分子的识别机制和信号转导机制研究。关于人T LR1的克隆和表达,国内尚未见报道。本研究拟扩增人T LR1胞外区cDNA,构建含TLR1胞外区基因的pET30a(+)-TLR1重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)。所获阳性克隆子可用于T LR1的原核表达,并用于其对病原分子的识别机制及信号转导机制研究,从而可进一步阐明TLR1相关免疫及炎症机制,为寻找新的治疗途径与靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人淋巴细胞分离液购自天津TBD公司,T RNzol Total RNA Reagent购自北京Tiangen公司;MM LV反转录酶购自美国Promega公司,TaKaRa LA Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司;胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京Tiangen公司;原核表达载体 pET30a(+)、E.coli BL21(DE3)由本研究室保存;T4 DNA连接酶购自Fermentas公司;其余试剂均为国产分析纯;引物合成由上海博尚生物技术有限公司完成,DNA测序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单个核细胞(PBMC)分离 采取健康志愿者外周静脉血(EDTA抗凝),按人淋巴细胞分离液试剂盒操作说明分离出PBMC,磷酸盐缓冲液(D-Hank′s液,pH 7.4)洗涤、重悬,备提取RNA用。

1.2.2 总 RNA提取 Trizol法提取 PBMC总 RNA,具体步骤按北京Tiangen公司的T RNzol Total RNA Reagent操作说明进行。总RNA进行-70℃保存。

1.2.3 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段 在基因库中根据人TLR1的Gene ID(7096)查找其基因序列,结合原核表达载体 pET30a(+)上的多克隆位点采用Primer Premier5.0设计一对TLR1胞外区基因扩增引物,并在其中引入酶切位点。上游引物:5′-GTC CCATGG CTA CTA GCA

TCT TCC ATT TT-3′;下 游引物 :5′-ATA GCGGCCGCTTA GTT GCA GGA TAA TCC AGA-3′。其中上游引物5′端引入NcoⅠ酶切位点(下划线表示),下游引物5′端引入 NotⅠ酶切位点(下划线表示)。以提取的人PBMC总RNA为模板,按常规方法建立逆转录反应体系及条件合成cDNA,采用降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)扩增目的基因。最适反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,30个循环;72℃再延伸10 min。1%TAE琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

1.2.4 重组原核表达载体的构建与鉴定 用NcoⅠ和NotⅠ分别双酶切纯化回收的目的基因片段和pET30a(+)质粒,经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收后,用T4 DNA连接酶将酶切后的目的基因和载体按摩尔比3∶1进行混合,16℃过夜连接。采用CaCl2法制备感受态 E.coli BL21(DE3),将重组体pET30a(+)-TLR1胞外区基因转化感受态表达菌株,涂布于Amp+的LB平板上,37℃温箱孵育16 h,挑取单个菌落于LB液体培养基中,扩大培养,做菌落PCR鉴定,对鉴定正确的质粒将其菌液送公司测序。

2 结 果

2.1 人PBMC总RNA的提取 紫外-可见分光光度计检测分析:总 RNA 浓度=280.6 ng/μ L,OD260/OD280=2.00,说明提取的RNA浓度较高,纯度好。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性:电泳结果清晰可见18 s和28 s条带,且约为2∶1(图1),表明 RNA无明显降解,此RNA制剂可直接用于 RTPCR。

2.2 T LR1胞外区基因的扩增 利用提取的总RNA,应用RT-PCR技术,所获扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见约1 735 bp大小片段(图2),与预期相符。表明目的基因扩增成功。

图1 PBMC总RNA琼脂糖凝胶电泳

图2 TLR1胞外区cDNA RT-PCR扩增

图3 菌落PCR验证转化了的TLR1胞外区cDNA阳性克隆子

2.3 重组表达载体的构建与鉴定 由T4 DNA连接酶连接双酶切后的目的基因和表达载体pET30a(+),转化感受态E.coli BL21(DE3)。菌落PCR鉴定,结果表明4个克隆子扩增产物电泳后都出现了一条1 735 bp左右的片段(图3);筛选出的阳性克隆子送上海生工测序,结果与GeneBank公布的TLR1序列一致(GeneBank登陆号:NM_003263)。证实插入序列与设计完全相符,成功构建重组表达载体T LR1胞外区基因pET30a(+)。

3 讨 论

TLR1作为T LRs家族的重要成员,其在机体免疫应答当中的作用日渐引起研究者的广泛关注。已知TLR1分布于多种免疫细胞,如单核细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等,可识别包括三酰基脂肽在内的多种菌体成分,通过TLR1/2异二聚体刺激免疫应答[7]。TLR1多态性可调节对脂肽的先天性免疫应答反应和对广谱致病菌的临床易感性[8]。Johnson等[9]报道TLR1单核苷酸多态性(I602S)与受体细胞表面的异常移位相关,可降低血单核细胞对细菌激动剂的应答,与麻风病的发病相关[10]。但总体来说,T LR1相关的研究还不是非常清楚和全面,对于TLR1识别微生物细胞壁成分以及细菌脂蛋白是直接的还是间接的,其识别机制怎样,以及TLR1还可识别其他哪些PAM Ps?其结构基础及相互作用机制如何,均有待进一步研究阐明。

本项目克隆的目的片段经表达后,可制备纯化的 TLR1胞外区蛋白,为后续研究提供重要的实验材料。(1)制备的TLR1胞外区蛋白可用于分析TLR1与病原体或其产物配体相互作用的识别机制。如研究T LR1能与哪些配体相作用,其作用方式如何,是直接作用还是间接作用等。(2)TLR1胞外区蛋白可用于后续实验筛选制备高亲和力、特异性强的人源单链抗体。相应的人源单链抗体又可用于对TLR1的阻断效应和基因沉默研究。此外,单链抗体基因结构简单,可进行基因操作,适合于细胞内表达。由此可将TLR1的人源单链抗体转染细胞,作为胞内抗体,干扰TLR1的功能,研究TLR1正常表达和受干扰后的细胞生物学效应。

综上所述,获取纯化的 TLR1胞外区蛋白后,可将其用于进一步研究T LR1对病原分子识别机制及信号转导机制,阐明TLR1相关免疫及炎症机制,为寻找新的治疗途径与靶点提供思路。

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