血清半乳甘露聚糖抗原动态检测对烧伤伴曲霉感染早期诊断的意义

向 军, 孙 珍, 徐正鹏, 夏俊星, 郇京宁

近年来,大面积烧伤并发侵袭性真菌感染有明显上升趋势。侵袭性真菌感染主要与念珠菌和曲霉相关,而曲霉感染比例日益增加。临床上诊断真菌感染的方法主要由宿主因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学4部分组成。由于烧伤患者真菌感染的临床表现不具有特异性,呼吸道和血培养标本真菌培养阳性率低,早期诊断非常困难[1]。半乳甘露聚糖(GM)是曲霉细胞壁上的一种多聚抗原,体内循环中GM检测较临床症状和影像学异常出现前数天表达阳性,其灵敏度和特异度均可达到80%以上。GM试验是当前比较标准的用于检测曲霉的方法,可以作为筛选指标之一,其连续检测,有助于早期诊断曲霉感染并及时用药[2]。但目前GM试验的临床界值尚未确定。本研究通过早期对大面积深度烧伤患者血清GM的动态检测,并结合临床诊断,初步探索烧伤患者曲霉感染的GM界值,为烧伤临床早期诊断提供依据。

材料与方法

一、研究对象

选择2008年6月—2009年5月上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科住院烧伤患者,以单次检测吸光度(A)指数＞0.5为入选标准,总计20例男性患者,平均年龄(33±11)岁,烧伤面积40%～95%,烧伤深度均为深度烧伤(深Ⅱ度至Ⅲ度)。所有患者入院后每周采血2次、共3周,共收集血标本120份。

二、方法

(一)血清GM测定 研究患者采血后24 h内离心分离出血清,-20℃冻存。GM测定采用Platelia Aspergillus试剂盒(Bio-Rad公司产品)。具体方法 ：300 μ L 血清与100 μ L 处理液混匀,100 ℃水浴3 min后以10 000 r/min离心10 min,取上清液待测;在96孔板中,每孔加结合液50 μ L和处理后的血清50 μ L(其中4孔为标准参照),封口,37℃水浴90 min,去封口膜,清洗、拍板循环5次,每孔吸干后加入显色液200 μ L,室温避光 30 min 后加终止液 100 μ L,在450 nm波长的酶标仪上读取A指数。

(二)诊断标准 参考2008年欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG)共识组的诊断标准[3]。确诊侵袭性真菌病的诊断标准要求穿刺或活检获取无菌组织标本,经显微镜检查发现菌丝或培养出霉。烧伤外科专业侵袭性真菌感染诊断意见参照《现代烧伤治疗》[4],主要包括：真菌自烧伤创面侵入,穿透到焦痂下并侵入邻近活组织;口腔黏膜培养到真菌,同时胃肠道黏膜下感染灶真菌培养阳性而两者菌种一致者;真菌菌血症伴有脏器转移。对大面积深度烧伤患者而言,临床上无法获取无菌标本组织,所以我们将检测对象分3类,拟诊病例、疑似病例和非曲霉感染病例。拟诊病例：患者至少符合1项宿主因素、1项临床标准和1项微生物学标准。疑似病例：至少符合1项宿主因素、1项临床标准,但无微生物学证据。患者定期做创面、气道分泌物、中段尿和血液的曲霉培养,并行X线胸片检查。对拟诊和疑似病例进行抗真菌药物治疗,并继续监测血清GM的变化。

(三)统计学分析 以拟诊病例和疑似病例为阳性组,非曲霉感染病例为阴性组作四格表分析。GM试验的灵敏度与特异度、阳性预测值与阴性预测值的计算公式如下：灵敏度(SEN)=a/(a+c)、特异度(SPE)=d/(b+d)、阳性预测值=a/(a+b)、阴性预测值=d/(c+d)。根据GM试验的 A值,设定0.5、1.0和 1.5共 3个界限,并分单次和连续 2次测定值,分别进行统计。并计算假阳性率[特异度=1-假阳性率=1-b/(b+d)]、假阴性率[灵敏度=1-假阴性率=1-c/(a+c)]。

结 果

一、临床的诊断结果

根据2008年EORTC/MSG共识组的诊断标准,同时参考烧伤专业的诊断意见,以及患者临床表现、创面与体液真菌培养、影像学检查的结果,本研究中有拟诊病例3例、疑似病例4例,其余13例则排除曲霉感染。

二、患者GM检测分布范围

根据血清GM试验A指数设定的3个界限：0.5、1.0和1.5,并分单次和连续2次测定值,拟诊病例、疑似病例和非曲霉感染病例的GM检测分布范围见表1。

表1 血清GM试验结果分布Table 1.Distribution of GM test results

三、血清GM试验的统计结果

根据不同评估界限,血清GM试验的灵敏度与特异度、阳性预测值与阴性预测值的统计结果,见表2。

表2 血清GM试验的统计结果Table 2.Analysis of sensitivity,specificity,positive and negative predictive values

四、A指数单次≥1.5者与临床曲霉感染阴性表现

纳入研究的20例患者中,单次A指数≥1.5且没有明确临床感染迹象者有3例,其中1例单次A指数达1.93。这3例患者均未发现曲霉感染临床征象,且实验室、影像学检查也不支持曲霉感染。根据灵敏度与特异度的统计结果,我们发现A指数单次≥1.5的假阳性率为37%,假阴性率为14%;连续2次≥1.5的假阳性率为 10%,假阴性率为29%。

五、连续检测GM值与疗效的关系

对拟诊和疑似的7例患者进行抗曲霉药物治疗,6例有效,1例死亡。在GM的连续监测中发现,死亡患者的血清GM值持续处于高水平,而抗曲霉治疗有效的患者血清GM值呈明显下降趋势。

讨 论

随着免疫抑制剂、广谱抗生素等的广泛应用以及器官移植、导管留置操作的普及,真菌感染的发病率不断升高。真菌感染主要与念珠菌和曲霉相关,两者占真菌感染的90%左右,而近期曲霉感染的发生率有稳定上升的趋势。曲霉感染的临床表现多样,其中尤为重要的类型是侵袭性曲霉病。侵袭性曲霉病指曲霉侵入人体组织、血液,并在其中生长繁殖引起组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理改变及病理生理过程,其特征为曲霉菌丝侵袭血管,需要及时诊断和早期积极有效的应用抗真菌药物。大面积深度烧伤患者,由于机体免疫力下降、防御功能严重受损、长时间使用广谱抗生素、创面坏死组织的存在等因素,曲霉感染的发生率很高[5]。烧伤后的曲霉感染有其特点[4],首先从有大量坏死组织的创面定植开始,然后穿透焦痂侵入皮下脂肪,侵犯静脉和淋巴管,进入血液后引起侵袭性感染,并在创面局部引起血栓形成、创面加深、肌肉坏死,对机体危害甚大。一旦发生了侵袭性曲霉感染,抗真菌药物的疗效将会大大降低,导致高病死率[6]。因此,对曲霉感染的早期诊断和及时药物治疗,与患者预后直接相关。

临床上常用检验真菌的方法,包括体液或创面的真菌培养、组织病理学检查、影像学检查等,对烧伤患者,临床意义均不大。创面病理活检或培养,由于标本不是无菌组织,检测结果也不能明确诊断。与血液病、肿瘤、肺部疾病并发真菌感染不同,大面积烧伤患者发生真菌感染,临床征象上一般无特异表现,同时其血象变化、影像学资料包括X线胸片也多数不具备诊断特征,并常为原发病所掩盖。曲霉的培养结果往往需要等待1～2周,而血培养的阳性率极低,而且阳性者标本污染的可能性较大。即使创面曲霉培养阳性,也无法区分是局部定植、还是侵袭性感染。曲霉病药物治疗的最佳时机在于感染早期,而目前烧伤临床上,由于诊断方法有限、担心延误治疗时机等原因,多数患者的抗真菌治疗依然只能凭临床经验,而经验性治疗的疗效仅为40%～50%,往往会造成治疗不足或过度治疗[7]。

血清学检测方法是近年来发展较快的能早期检验真菌感染手段之一。GM试验是一种通过酶联免疫吸附法检测血清中曲霉半乳甘露聚糖抗原以协助诊断真菌感染的方法,其灵敏度为50%～90%,特异度为80%～90%。这项检测已被美国FDA和欧洲许多国家批准用于血液、肿瘤等免疫受损者中侵袭性真菌感染的诊断[8]。研究证实,ELISA法检测GM对诊断曲霉病具有较高的特异度;同时,有2/3患者在临床症状和影像学表现出现之前数天至1周,ELISA法测定的血清GM即可以获得阳性结果,对高危患者连续动态监测(每周2次)具有早期诊断的价值,并证实监测血清GM含量动态变化同样有利于治疗效果和病情发展的判断[9]。但问题是其灵敏度报道差异很大,在30%～100%,主要原因之一是所采取的检测界值不同。目前关于血清GM检测界值尚存争论。临床上常用ELISA法,试剂盒为Platelia Aspergillus。同样的试剂与方法测定曲霉抗原,不同国家和地区判定的界值尚不统一,欧洲多采用1.0或1.5的界值标准,且连续2次阳性提示血清GM阳性;而2003年美国FDA将界值下调至0.5,虽然灵敏度有一定提高,但是0.5～1.5之间的可疑阳性范围给诊断带来很大的差异。血清GM试验用于烧伤伴曲霉感染的诊断和治疗评估还刚起步,对烧伤患者来讲,明确其诊断界值十分重要,因此,我们做了这方面的初步探索。在患者人选上,我们把具有宿主高危因素的大面积深度烧伤患者纳入本研究;并依据美国FDA的界值标准,将单次A指数＞0.5作为入选条件。

通过对20例、单次A指数＞0.5的大面积深度烧伤患者,每周2次、共3周动态检测发现：连续2次≥1.0,灵敏度71%,特异度 73%;连续 2次 ＞1.5,灵敏度71%,特异度90%;而相对应地,单次≥1.0,灵敏度86%,特异度 54%;单次＞1.5,灵敏度86%,特异度63%。同时,通过对试验的阳性预测值、阴性预测值进行统计比较,结合烧伤伴曲霉感染的临床特点等多方面因素分析,初步发现,对大面积烧伤患者而言,GM试验阳性值界定为连续2次A指数≥1.5的临床参考价值较大。本研究还发现,纳入研究的患者中,单次A指数＞1.5且没有临床感染迹象者有3例,这些患者也没有曲霉感染实验室依据,提示有一定的假阳性。假阳性主要见于以下情况：标本被青霉属、镰刀霉、毛霉等污染,接受哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-克拉维酸等青霉素类抗生素治疗,许多食物尤其是牛奶制品中含有半乳甘露聚糖,均可引起假阳性。此外,由于曲霉释放入血浆中的GM不是持续存在而是会被很快清除,成为造成假阴性的原因之一,多次复查可以提高检出率[10]。血清GM动态检测还发现,应用抗曲霉的药物治疗后,治疗有效患者的GM值呈明显的下降趋势,无效者则持续高表达,从而提示GM 的动态检测,对烧伤曲霉感染患者的治疗疗效评估有一定意义。

本研究结果提示,动态检测血清GM抗原水平变化,对于大面积烧伤患者伴曲霉感染的早期诊断具有重要意义,且连续2次血清A指数≥1.5的临床参考价值较大。由于本研究的样本量偏小,进一步大样本的调查、分析是必要的;同时,对于抗真菌治疗过程中,GM 值变化对药物疗效的评估价值,也尚需更多的临床资料和分析。

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