T淋巴细胞斑点试验在结核病诊断中的应用

苏俊华, 朱莉莉, 陈建华, 保 凌, 赵 勤, 梁桂亮, 杨慧仙, 施巧霞, 段志妹

近年来,结核病的发病率有上升趋势。目前全球每年新增病例约800万例[1],我国是世界上仅次于印度的第2个结核病大国,结核感染率为44.5%,活动性结核患者450万,每年死亡人数达13万[2]。世界卫生组织2004年的报告显示,结核病诊断率仅为37%,即使在发达国家也仅有50%的结核病例通过细菌学方法被证实[3]。我院常用的细菌学检测方法是痰、肺泡灌洗液和支气管毛刷检物涂片、镜检法和培养法,以及分子生物学技术(TB-DNA)检测、结核抗体和精制结核菌素试验(PPD)等检测项目,其中痰涂片抗酸杆菌阳性率2007—2008年仅为23%左右,而传统的结核分枝杆菌罗氏培养因灵敏度低,检测周期长等原因,临床未作为常规检测项目,因此寻找一种准确快速可靠的诊断结核的方法十分迫切。

最近几年,一些国家和地区以及我国的上海等地已经将酶联免疫斑点技术(ELISPOT)用于结核病的诊断,相关报道日益增多。结核分枝杆菌感染T淋巴细胞斑点试验(T-Spot.TB)是由ELISPOT发展而来,为考察此技术在我院的应用情况,特进行下列试验,现将结果报道如下。

材料与方法

一、研究对象

确诊结核组[以痰涂片抗酸杆菌和(或)结核分枝杆菌培养阳性为标准]30例,其中23例肺结核,7例肺外结核,年龄1～65岁。男 21例,女 9例。其中结核住院患者23例,HIV合并结核感染7例。怀疑结核组53例,该组患者临床及影像学疑似结核,但痰涂片抗酸杆菌及结核分枝杆菌培养均为阴性。53例中44例疑似肺结核,9例疑似肺外结核。年龄19～80岁,男35例,女 18例。其中 24例为HIV感染者。正常对照组32名,其中健康体检者28名,余4例为排除结核感染的呼吸道感染住院患者。年龄22～61岁,男8名,女24名。

二、仪器和试剂

Baker生物安全柜,RIVCO CO2孵育箱。TSpot.TB试剂盒(英国牛津Immunotec生产),淋巴细胞分离液、AIMV、RPMI1640由上海长征复星公司提供。

三、原理和方法

(一)原理 T-Spot.TB技术是利用结核分枝杆菌感染外周血单个核细胞(PBMC)中存在结核特异性T细胞,这些T淋巴细胞在受到结核分枝杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-γ。PBMC和结核特异的混合抗原A(ESAT-6)和混合抗原B(CFP-10)与对照试剂一起加入预包被干扰素抗体的微孔板进行培养孵育。当PBMC中存在特异性T细胞时,培养液中加入的结核分枝杆菌特异混合抗原多肽A和多肽B将刺激其分泌。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ捕获,再次加入的碱性磷酸酶标记抗体与被捕获的IFN-γ相结合,滞留在微孔板上,加入显色底物溶液在反应部位形成不溶性色素沉着斑点。每1个斑点代表1个结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞,根据斑点数可以判断体内是否存在针对结核分枝杆菌反应的效应T细胞,并可计数T细胞的数量。

(二)方法 ①采集4 mL外周血标本置于肝素锂抗凝的试管中,立即混匀,在4 h内进行PBMC分离。②离心管中预先加入4 mL RPMI 1640液,将混匀的4 mL抗凝全血加入离心管中,混匀。③另一离心管中预先加入3 mL淋巴细胞分离液,将混匀的8 mL细胞悬液缓慢加入淋巴细胞分离液上方,1 600 g离心22 min,用加样枪吸取白细胞层到15 mL离心管中。④再加入RPMI 1640至11 mL,600 g离心7 min,弃去上清液。⑤加入AIMV培养液至11 mL,350 g离心7 min,弃去上清液。⑥加入0.7 mL AIMV液,充分摇匀使细胞悬液混匀。吸取10 μ L细胞悬液于40 μ L锥虫兰染液中混匀,再吸取10 μ L加入细胞计数板上计数。

每份标本调整至每毫升250万个PBMC。取出T-Spot.TB试剂盒内微孔板,根据标本量取出板条。1份标本需4个微孔板,阴性对照加AIMV,阳性对照加植物血凝素(试剂盒内提供),另外2个孔分别加入抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)各50 μ L,然后每孔分别加入 100 μ L细胞悬液(即含有250 000个PBMC的悬液)。将微孔板放入5%CO2孵箱中孵育16～20 h,用 pH6.8～7.2的 PBS液洗板。加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体50 μ L,2～8℃冰箱孵育1 h,再用PBS液洗板,最后每孔加入显色液50 μ L。避光室温静置7 min,用蒸馏水冲洗后观察结果。用放大镜观察记录每个孔中的斑点。

(三)结果判定 依据试剂盒内所附判定标准进行,阴性斑点数为0～5个,抗原A和抗原B检测孔计数-阴性孔计数≥6判为阳性。如果阴性对照孔斑点数≥6,检测孔斑点数≥2倍阴性孔斑点数判为阳性。

结 果

确诊结核组：即痰涂片抗酸杆菌阳性或其他体液标本涂片阳性和(或)结核分枝杆菌培养阳性的病例。30个标本中,检测结果阳性25例,检测灵敏度为83.3%(25/30)。正常对照组：共检测32例,检测结果阳性6例,阴性26例,特异度为81.3%(26/32)。疑似结核组：该组患者临床及影像学疑似结核,但涂片及培养均为阴性。本组病例53例,检测阳性28例,阳性率为52.8%(28/53)。T-Spot.TB试验结果分布见表1。

表1 T-Spot.TB实验结果和治疗效果的比较Table 1.Comparison between results of T-Spot TB and clinical outcome

对肺外结核的检测结果：共有16例,入组的肺外结核包括结核性脑膜炎4例、结核性胸膜炎2例、肾结核1例、结核性腹膜炎4例、关节结核1例和淋巴结核4例,T-Spot.TB阳性13例,阳性率达81.2%。

讨 论

在确诊结核组中T-Spot.TB结果阴性者5例,有2例是在抗结核疗程超过1个月后进行检测。有报道指出效应T淋巴细胞存活期很短,一般在病原体消灭后就消失[4]。所以我们推测这2例患者可能是治疗后患者特异的T细胞计数迅速降低,故 TSpot.TB检测阴性。另有报道严重的肺结核抑制了外周血T淋巴细胞的反应,可能导致这些患者缺乏可以检测到分泌IFN-γ的特异T细胞。

正常对照组中T-Spot.TB结果阳性的6例标本,其中4例的标本来自健康体检者,均为我科工作人员,年龄25～35岁,平时工作中与结核患者及其标本均有接触,接触时间平均4年,属高危人群。由于目前国际尚无结核隐性感染诊断的金标准,无法进行验证和排除,这4名体检者可能为隐性感染者,另2例均为肿瘤患者,他们是否也存在潜伏感染尚不能证实。

从表1中我们可以看出疑似结核组：①抗结核治疗有效28例,其中19例T-Spot.TB结果阳性,与最后临床诊断符合率是67.9%(19/28),即阳性预测值;9例T-Spot.TB结果为阴性,经抗结核治疗有效。值得注意的是9例中7例为HIV感染合并结核,他们在该试验中的低反应性可能是由于HIV相关的CD4细胞减少所致,由于检测病例太少,我们未做相关CD4计数的对比。赞比亚的一项研究表明,RD1基因产物ELTSpot实验的阳性反应率在HIV感染者是降低的[5]。②19例进行抗感染对症治疗等措施,16例治愈好转,其中12例 TSpot TB阴性,4例阳性,试验阴性与临床诊断排除结核者的符合率为75.0%(12/16),即阴性预测值;假阳性率为25.0%(4/16)。假阳性的4例中有1例是陈旧性结核,现在是以十二指肠炎住院,对症治疗后出院,该例患者不能排除其体内还存在结核分枝杆菌,另外4例中有3例PPD阳性,他们有可能为潜伏感染者。

在实际观察中,T-Spot.TB检测的灵敏度83.3%,特异度为81.3%。这2个数据均低于国内外的相关报道[3-6]。分析其灵敏度较低可能因为TSpot.TB是基于免疫反应,纳入确诊结核组中有部分HIV感染患者,其免疫力低下所致;特异度观察中,我们纳入了与结核病有密切接触者,可能存在潜伏感染而降低了特异度。现在我国的现状结核病的诊断率不足60%[3],PPD的灵敏度约为60%,但免疫低下患者阳性率仅为20%～30%,虽然该试验操作方便、观察结果容易,但灵敏度和特异度均不理想,曾经有结核感染和接种卡介苗都可能出现假阳性,临床诊断的意义不大;结核抗体检查同样存在特异性不高的情况,所以临床怀疑结核而又无病原学资料时,T-Spot.TB试验结果对临床有指导价值,T-Spot.TB阳性者67.9%可能是结核(阳性预测值)。若T-Spot.TB试验阴性,75.0%的概率可以排除结核感染(阴性预测值)。

综合以上分析和国内外的一些研究,T-Spot.TB技术作为一种新的检测结核感染的免疫学方法,它提高了结核检测阳性率,可作为结核病早期诊断的一项辅助检查手段,可用于临床症状不典型、PPD诊断不明确和痰涂片培养均为阴性的疑似结核患者,此检查方法具有较高的灵敏度和特异度,对肺外结核的诊断也很有价值。T-Spot.TB试验采用外周血检测,简便易行,并且能快速出结果(第2天)。T-Spot.TB的应用不仅可使患者得到早期诊断,及时治疗避免误诊,减少抗药性,节省医疗费用;测定效应T淋巴细胞也可以反应机体是否清除了病原体,作为判断治疗是否有效的一项指标[4]。但T-Spot.TB检测试剂盒价格昂贵,对低收入患者及地区有一定困难。

[1] Global tuberculosis control：surverllance,planning,financing.WHO report2005.GeneraWorld Health Organization(WHO/HTM/TB/2005.349).

[2] 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志,2002,24(2)：65-108.

[3] 乐军,梁莉,李苏辉,等.酶联免疫斑点试验快速诊断结核分枝杆菌感染的临床应用价值[J].中华检验医学杂志,2006,29(11)：1005-1008.

[4] 史可云,胡忠义.酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用现状[J].中华结核和呼吸杂志,2006,29(6)：414-416.

[5] Chapman A L,Munkanta M,Wilkinson KA,et al.Rapid detection of active and latent tuberculousis infection in HIVPositive indicicluals by enumeration of Mycobaterium tuberculosis-specific T cells[J].AIDS,2002,16(17)：2285-2293.

[6] Meier T,Eulenbruch HP,Wrighton-Smith P,et al.Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay(T Spot-TB)for diagnosis of tuberculosis in clinical practice[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2005,24(8)：529-536.