204株肺炎链球菌的分离鉴定与耐药性分析

张 曦

四川省自贡市第四人民医院（643000）

肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae）为链球菌科、链球菌属细菌，革兰染色阳性。它不产生内、外毒素，其致病性主要是荚膜的侵袭作用。根据荚膜抗原性，肺炎链球菌已分出86个血清型，成人致病菌以1～9型居多，其中第3型毒力最强；而儿童多为6、14、19及23型。它常寄生于人体鼻咽部，是社区获得性肺炎的主要致病原之一，而且它还可引起脑膜炎、心内膜炎、中耳炎、鼻窦炎、败血症等疾病。美国临床和实验室标准协会（CLSI）规定，最小抑菌浓度（MIC）≥2μg/mL为青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP），MIC为0.12～1.0μg/mL为青霉素中度耐药（PISP）或称低度耐药肺炎链球菌，MIC≤0.06μg/mL为青霉素敏感肺炎链球菌（PSSP），PNSP包括PRSP和PISP。近年来，肺炎链球菌对青霉素等多种抗菌药物耐药性在全球普遍呈上升趋势。为了解自贡市第四人民医院近几年的肺炎链球菌耐药情况，本文对自贡市第四人民医院肺炎链球菌耐药情况进行了分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2006年7月至2009年6月自贡市第四人民医院门诊和住院患者分离、培养肺炎链球菌共204株，其中痰标本67.2% （137 /204）、鼻咽拭子24.5%（50/204）、血液标本7.3% （15/204）、引流液和脓汁1.0% （2/204） 。

1.2 试剂与材料

MH基础琼脂加5%绵羊血、肉汤、optochin纸片（5μg/片） 、苯唑西林、四环素、红霉素、克林霉素、头孢噻肟、氯霉素、氧氟沙星、万古霉素药敏纸片均购自英国OXOID公司。

1.3 细菌鉴定

将采集的标本接种于血平板，置于5%CO2，35℃过夜孵育18～24h。挑选菌落周围有草绿色溶血环、细小、灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落，或中央塌陷、边缘隆起、呈脐窝状的可疑菌落，或表面光滑、湿润有粘液的可疑菌落，进行革兰染色、optochin试验胆汁溶解试验、菊糖发酵试验，还可结合荚膜染色、触酶试验和其他生化反应进行手工鉴定，也可利用VITEK-2全自动鉴定仪进行鉴定。质控菌株ATCC49619跟随整个过程。

1.4 药敏试验

用改良Kirby-Bauer法和微量肉汤稀释法进行抗生素敏感性试验，试验操作及结果判读按美国临床试验室国家标准化委员会（NCCLS）制订的最新规则及标准进行。用1.5×108CFU/mL肺炎链球菌悬液接种于含5%羊血的MHA上，然后贴1μg/片的苯唑西林纸片，35℃温育24h，如果抑菌环直径≥20mm为青霉素敏感，＜20mm者，测定对青霉素的MIC值，如果MIC≤0.06μg/mL为敏感、0.12～1μg/mL为中度耐药、≥2.0μg/mL为高度耐药。结果判断按照NCCLS2005年标准。质控菌株ATCC49619跟随整个过程。

1.5 统计分析

使用WHONET 5.3微生物实验室数据管理软件处理数据。

2 结 果

2.1 204株肺炎链球菌的耐药率

自贡市第四人民医院万古霉素敏感率最高，无耐药株，其他抗生素都有，见表1。

对四环素、红霉素、克林霉素有较高的耐药率，分别为83.3%、89.2%、90.2%。肺炎链球菌对青霉素的耐药情况：2006年7月至2007年6月、2007年7月至2008年6月、2008年7月至2009年6月青霉素对肺炎链球菌耐药率分别为42.2% （27/64）、51.1% （45/88）、67.3%（35/52）。

表1 204株肺炎链球菌的耐药率抗生素

2.2 PNSSP菌株的青霉素MIC值分布

2006年7月至2009年6月共检出PNSSP菌株107株，其青霉素MIC值分布见表2，中介73株（68.2%），耐药34株（31.8%）。2006年7月至2007年6月耐药株占PNSSP的比率为22.2% （6/27），2007年7月至2008年6月比率为26.7% （12/45），2008年7月至2009年6月为45.7%（16/35）。每年PNSSP菌株呈上升趋势，到2009年PNSSP的MIC值更是高达6μg/mL。

3 讨 论

随着对青霉素耐药性的升高，肺炎链球菌对头孢霉素、四环素和氯霉素的敏感性下降，抗生素耐药菌株亦随之增多。此外，对多种抗生素耐药的肺炎链球菌均为耐青霉素株。据此我们认为，由于对青霉素耐药株对其他多数抗生素亦不敏感，因此无论临床还是实验室都应将肺炎链球菌的青霉素耐药株与敏感株严格区分，以便针对用药。

肺炎链球菌对青霉素的耐药机制是，青霉素结合蛋白（PBP）是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。肺炎链球菌对青霉素耐药的机制主要是细菌细胞壁上的PBP基因发生变异，随即高分子量PBP的结构发生改变，使其对抗生素分子的亲和力降低而产生耐药。通常单独的PBP基因变异只会造成低耐药菌株，而高水平耐药通常是多个PBP联合变异的结果。因为PRSP由PBP变异所致，所以或多或少涉及到头孢菌素，这就是PRSP对头孢菌素耐药的根本原因。不同地区肺炎链球菌的耐药性不一样。自贡市第四人民医院青霉素的耐药率为52.5%，表明自贡地区肺炎链球菌对青霉素的耐药情况严重。统计自贡市第四人民医院3年来肺炎链球菌对青霉素的耐药率，2006年7月至2007年6月耐药率为42.2%，2007年7月至2008年6月耐药率51.1%，到2009年6月升至67.3%，呈上升趋势。因此，抗生素的选择通常以达到有效治疗并尽可能少地诱导耐药产生为原则，凡青霉素MIC≤2μg/mL的敏感和中介菌株感染仍可选择高剂量青霉素G、阿莫西林、氨苄西林或头孢菌素中的头孢丙烯、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟以及头孢泊肟等对肺炎链球菌有良好抗感染活性的口服二、三代头孢菌素。2007年美国感染病学会/美国胸科学会（IDSA/ATS）在CAP指南中建议：高水平耐药PRSP感染或存在耐药高危因素的CAP患者，可选用呼吸氟喹诺酮类或β-内酰胺类联合大环内酯类治疗。我国肺炎链球菌对大环内酯类耐药率普遍在60%以上，且多呈高水平耐药，因此在疑似肺炎链球菌所致CAP时不宜单用大环内酯类治疗。PNSSP菌株的青霉素MIC值分布特点：自贡市第四人民医院PNSSP耐药菌株比率增加，最大青霉素MIC值逐年增加，且菌株青霉素MIC值分布逐渐向较高数值范围移动，显示PNSSP对青霉素的耐药性增强，呈上升趋势。自贡市第四人民医院分离的PNSSP以中介菌株为主，占72.9%。提示青霉素若加大剂量联合用药仍可作为经验治疗并要对其进行耐药性监测。

本资料中，肺炎链球菌对红霉素、四环素、克林霉素的耐药率分为89.2%、83.3%、90.2%，表明大环内酯类、克林霉素、四环素不适于肺炎链球菌感染。本资料显示，氯霉素、氧氟沙星和万古霉素对肺炎链球菌有较高的抗菌活性，尤其是万古霉素未见耐药株。但由于万古霉素的不良反应限制其在临床的使用，氯霉素和氧氟沙星可作为青霉素不敏感菌株及青霉素过敏患者治疗选用药物，而且近年来有人认为喹诺酮类抗生素并不会对儿童软骨发育造成损害[1]，随着对这个问题的研究的深入和此类新药的开发，它的应用前景十分乐观。

表2 2006年7月至2009年6月PNSSP菌株的青霉素MIC值分布

综合以上分析，自贡市第四人民医院肺炎链球菌耐药情况较为严重，万古霉素、氧氟沙星、氯霉素保持较好的抗菌活性，对头孢噻肟还比较敏感，对红霉素、四环素、克林霉素普遍耐药。肺炎链球菌对抗菌药物的耐药状况已非常严峻，必须严格规范抗菌药物的使用和加强肺炎链球菌耐药性和抗菌药物使用情况的监测，提高监测范围广泛性和时间连续性，及时调整经验用药方案和公共卫生策略[2]，从而阻止细菌耐药状况的进一步恶化。

[1]李海永,邢莉.氟哌酸对儿童骨关节影响的临床观察[J].中国厂矿医学,2003,16 (4):296.

[2]吴本权,唐英春,朱家馨等.广州市区两幼儿园2～6岁健康儿童肺炎链球菌携带状况调查[J].中国当代儿科杂志,2001,3(5): 529-531.