依普利酮对自发性高血压大鼠心肌缝隙连接蛋白Cx43表达的影响及干预

谭力力 于 波* 李 璐 赵红丽 郭 旭

1 沈阳医学院沈洲医院心内科（110002）

2 中国医科大学附属第一医院心内科（110000）

3 沈阳医学院附属中心医院（110000）

肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS）是一类重要的生物活性物质，广泛存在于多种组织。RAS系统在生理情况下对血压调控、水盐代谢起着重要作用，而在病理情况下，组织中RAS增加与高血压、动脉粥样硬化、细胞凋亡、心力衰竭等密切相关。而缝隙连接蛋白43（Cx43）是心室肌细胞含量最丰富的连接蛋白，其表达水平的降低和分布异常，可使心肌细胞间的传导发生改变，形成折返环路而发生室性心律失常[1]。临床研究发现，冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭患者心肌中Cx43基因和蛋白表达都明显下调，其表达分布的异常将引起恶性室性心律失常和心源性猝死的发生[2]。长期的高血压可以导致心肌纤维化和左室重塑，而高血压与Cx43及醛固酮受体拮抗剂对其的干预机制却鲜有报道，因此本实验采用Wistar大鼠和SHR大鼠为模型，就醛固酮对Cx43表达的影响及依普利酮对其的干预作进一步的研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物及药品

取20只8周雄性自发性高血压大鼠（体质量200g左右）分为高血压组（A组），依普利酮组（B组），每组10只，再取同周龄雄性Wistar大鼠（均购于北京维通丽华公司）10只（C组），次日晨B组空腹加喂依普利酮（购于博士德公司），100mg/（kg·d）[3]灌胃；A组和C组给予生理盐水灌胃，均喂养8周。

1.2 在体研究

分别于喂养2、4、6、8周采用大鼠尾动脉测压仪测量大鼠尾动脉压，比较血压的波动情况。

1.3 标本采集及处理

取部分心肌组织置于40g/L中性甲醛液中固定，石蜡包埋，取2张切片，其中1张用于HE染色，以观察心肌组织的大致形态及纤维化程度，另1张用于免疫组织化学染色，观察Cx43分布情况。

1.4 心肌HE染色

首先，将切片放于85℃烤箱内，烘烤切片约10min；然后，将该切片浸泡于二甲苯中10min，后更换二甲苯再浸泡10min，再水洗；用1%的苏木素中染色3min；放入盐酸酒精浓度1%进行分色，再流水冲洗反蓝；用0.5%伊木红染液进行染色3min，再流水冲洗，放入双蒸水，树胶封片，在光学显微镜下观察心肌纤维化的变化程度。

1.5 心肌Cx43 的分布情况采用免疫组织化学方法观察

实验步骤按试剂说明书进行（试剂购自博士德生物工程公司）。用彩色医学图文分析系统，对Cx43 表达分布进行观察分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 血压比较

3组大鼠尾动脉血压显示，高血压组平均动脉压较Wistar组显著升高；依普利酮组平均动脉压较高血压组显著降低，而和Wistar组无显著差异（比较中P＜0.01），见表1。

表1 组大鼠尾动脉血压比较（mmHg）

2.2 各组大鼠心肌病理的变化

大鼠心肌组织纤维分布正常对照组均匀纤细；高血压组心肌纤维排列紊乱、纤维粗大，而依普利酮干预后，心肌纤维化程度明显改善（图1）。

图1 各组大鼠心肌病理的变化

2.3 免疫组织化学学染色

染色后，观察Wistar组心室肌Cx43阳性的缝隙连接蛋白（棕色颗粒状）分布密集，排列规律，位于心肌细胞长轴的彼此连接处，而高血压组Cx43在心肌细胞的分布呈侧边化，依普利酮组Cx43分布不均、程度明显减轻（图2）。

图2 心肌Cx43免疫组织化学染色观察

3 分 析

目前，高血压以经成为临床一种常见病、多发病，长期的高血压可以导致心室重塑和心肌纤维化，心室肥大、心力衰竭。心肌肥大明显增加心血管病病死率，其机制与心肌肥大所致的电生理重构有关。而细胞缝隙连接（Gap Junction，GJ）是心肌细胞间惟一具有电连接作用的细胞间连接形式，对细胞的新陈代谢、内环境稳定等生理过程也起着重要的调控作用[4]。在连接蛋白中，其中Cx43 在心肌中最为重要，Cx43和分布的异常是多种心律失常的基础。

RAS系统的激活，一方面可导致细胞内Ca2+内流增加，细胞内Ca2+含量增加可激活Ca2+依赖的蛋白酶Calpains，导致溶酶体释放[5]，而且可激活钙调神经磷酸酶（calaineuin，CaN），使Cx43肽链C端368位点去磷酸化，从而使Cx43降解增加，含量降低。Cx43降解后重新分布，多数转移到细胞侧边，正如实验结果所示：正常心肌Cx43阳性的GJ分布密集，排列规律。而高血压组心肌纵切面缝隙连接蛋白分布紊乱，甚至缺如。从而使心肌细胞各向性的传导不均衡，电传波不一致，导致传导速度和方向改变，产生折返性心律失常。上述变化尤以心室肌明显，考虑与Cx43主要分布在心室有关。长期的高血压可导致心室重塑，而Cx43主要分布在心室，可以推出高血压大鼠心肌Cx43数量减少，分布紊乱，与本实验相符，而给予醛固酮受体拮抗剂依普利酮干预后，Cx43较高血压组比较，数量增加，分布规律。推测其作用机制可能是通过抑制醛固酮的释放进而降低心肌细胞内Ca2+水平，抑制与Ca2+有关的蛋白酶的合成、释放，减轻Cx43的降解，从而减轻Cx43分布紊乱程度。

醛固酮受体拮抗剂一般用于心功能不全和高血压左室肥厚患者，近年来的研究发现，在使用螺内酯后缺血/再灌注心律失常的发生率降低，显示醛固酮受体拮抗剂具有一定的抗心律失常作用。许多学者认为，醛固酮受体拮抗剂防治室性心律失常的作用机制主要与抗心室心肌纤维化、抗结构重构和抗电重构等机制有关。有研究显示，Cx43表达和分布异常可以导致细胞间传导减慢和电传导耦联能力的下降，从而引起多种心律失常。本研究发现，使用依普利酮后，高血压所致Cx43含量减少的程度较未用药组减轻，分布不均一改善，提示醛固酮受体拮抗剂能有效减轻心室Cx43的重构，但其具体机制需做进一步的研究。

[1]Gutstein DE,Morly GE,Tamaddon H,et al.Counduction slowing and sudden arrhythmic death in mice with cardiac restricted inactivation of connexin43[J].Circ Res,2001,88(3):333.

[2]Poelzing S,Rosenbaum DS .Nature,signiticance,and mechanisms of electrical heterogeneities in ventricle[J].Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol,2004,2(1):10.

[3]任志龙,梁伟,胡凤琪等.依普利酮对醛固酮灌注大鼠肾小球细胞凋亡的影响[J].临床肾脏病杂志,2008,8(5):223-226.

[4]Cruciani V,Mikalsen SO.Connexins,gap junction intercellular communication and kinases [J].Biol Cell,2002,94(7/8): 433-443.

[5]张家明,李大强,于世龙等.坎地沙坦对家兔快速心房刺激所致缝隙连接蛋白40的影响[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2005,19(5):385-387.