猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立

职爱民 左建军 黄志毅 邹仕庚 冯定远

肠粘膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)是肠道的重要功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能关系十分密切。长期以来，在研究IEC的生物学功能、细胞增殖和分化的调控因素，物质吸收与代谢等多采用肠道肿瘤细胞系为试验模型[1]。然而癌细胞是非正常的细胞，其生理特征明显不同于正常细胞，单纯由癌细胞系的研究结果来解释正常细胞的行为，明显有其不足。原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，原代培养的细胞生物学特性变化较少，最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载体。国外早在1993年就有猪肠细胞原代培养的报道[2]，其它类型的猪组织细胞原代培养的报道也不少[3-5]，国内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动物身上[6-9]，而关于猪IEC原代培养的方法一直属于空白。本试验的目的就是通过机械和酶消化结合的方法建立猪IEC原代培养的系统，为猪肠道营养的研究提供新的试验材料。

1 试验材料

1.1 试验动物

新生杜×长×大三元杂交仔猪（未吮奶），购于广东省原种猪场。

1.2 主要仪器设备与试剂

NU-2500型CO2细胞培养箱(Nuaire公司，美国)；IX70型倒置生物显微镜(Olympus公司，日本)；5804R型高速大容量冷冻离心机(Eppendorf公司,德国)；SWCJ-1F型超净工作台(苏州净化，中国)；HVE-50型高压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA公司，日本)；GF-M2000型酶标仪（山东高密彩虹仪器公司）；CS101-2AB型鼓风干燥箱(重庆试验设备厂)；79-1型磁力加热搅拌器(江苏金坛荣华仪器总厂)；Orion420A+型酸度计(Thermo Electron公司，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶和胶原酶Ⅱ型(Gibico公司)，标准胎牛血清（杭州四季青公司），青霉素、链霉素、β-甘油磷酸钠、硝酸钴、硫化铵(Sigma 公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、丙酮、硝酸钙、硫酸镁等试剂均为国产、分析纯。

2 试验方法

2.1 猪IEC的分离培养

2.1.1 主要试剂配制

按照说明书配制DMEM-F12不完全培养基，0.22 μm过滤除菌，分装，4℃避光保存备用。1 gⅡ型胶原酶干粉溶于100 ml上述配好的DMEM-F12不完全培养液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，1.5 ml Eppendorf管以1 ml/管分装，-20℃保存备用。DMEM-F12完全培养基为DMEM-F12不完全培养基加10%的胎牛血清。

2.1.2 猪IEC的分离

参照文献报道的方法[10－11]并根据实际情况调整,具体如下:将刚出生未吮乳的仔猪颈动脉放血处死,75%的酒精擦洗消毒后，置于超净工作台。无菌条件下打开腹腔,整体分离肠道,迅速投入盛有15 ml 37℃预热DMEM-F12不完全培养基的平皿中；分别取十二指肠、回肠和空场各15 cm左右，沿纵向剪开，培养基冲洗三遍并用玻片轻轻刮去表面杂物；清洗后的培养基转移到新的盛有15 ml 37℃预热DMEM-F12不完全培养基的平皿中，取出小肠，DMEM-F12培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻分离肠粘膜组织；用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入Ⅱ型胶原酶至0.1%终浓度；分别置4℃和37℃各消化12 h和2 h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，1000 r/min离心10 min后移去上清并用DMEM-F12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按（1～5）×105密度接种，37 ℃、5%CO2培养。

2.2 猪IEC的传代培养

移除培养液，PBS冲洗细胞两次，然后加入0.25%的胰酶，镜下观察大部分细胞回缩呈椭圆形时小心移除消化液，加入完全培养液吹打细胞悬液，使其均匀，调整所需细胞密度，接种后置于37℃、5%CO2培养。

2.3 MTT法测定猪IEC的增殖

四甲基偶氮唑蓝(MTT)母液(5 mg/ml)：称取250 mg MTT，溶于50 ml PBS中，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,分装后-20℃避光保存备用。

参照Sladowski的方法并做改进[12]，具体如下：将细胞悬液稀释为5×104个/ml，接种于96孔细胞培养板内，每孔 200 μl。共接 10板。分别于接种后 24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 取一板细胞，吸去培养液，在每孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，入培养箱继续培养6 h，取出弃上清液，用PBS清洗一遍后每孔中加入200 μl DMSO，室温下放置30 min，用酶标仪读取490 nm处吸光值(OD490)。

2.4 猪IEC的鉴定

2.4.1 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的鉴定

取生长良好的细胞，吸去培养液，用PBS洗细胞3次；80%冷丙酮固定10 min，吸弃，PBS洗3次；加入酶反应基质液 （2%巴比妥钠1 ml、3%β-甘油磷酸钠1 ml、2%硝酸钙 2 ml、2%硫酸镁 1 ml、蒸馏水 5 ml,pH=9.2～9.4）37℃反应2 h,吸弃，PBS洗3次；加入2%硝酸钙2 min,吸弃，PBS洗3次；加入2%硝酸钴2 min后吸弃;加入2%硫化铵，放入37℃培养箱10 min，吸弃；流水冲洗，镜检。

2.4.2 免疫学方法鉴定

在96孔板中接种密度为1×105个/ml的细胞悬液，每孔100 μl，接种4 d后进行IEC角蛋白8的免疫酶联反应，以肌细胞作为阴性对照。具体操作步骤如下：80%冷丙酮固定10 min,吸干多余的冷丙酮；用PBS 洗细胞 2 min×3 次；吸去多余的 PBST,加 50 μl封闭液于孔中,37℃孵育10 min；吸干液体,并用PBST洗2 min×3次；每孔细胞加 100 μl的一抗（鼠抗人角蛋白 8单抗）,37℃温育 30 min；PBST洗 2 min×3次;每孔加50 μl抗小鼠生物素二抗,37℃孵育20 min;PBS洗2 min×3次；每孔加50 μl HRP标记链亲和素，37℃孵育 20 min；PBS洗 2 min×3次现用现配 DAB显色液 （DAB底物缓冲液：DAB显色液： 底物溶液： 三蒸水=1：1： 1： 20）；每孔加 50 μl DAB 显色液，室温显色2～5 min；自来水冲洗，镜检。

3 结果

3.1 猪IEC的分离培养

无菌分离后小肠，可以观察到悬浮于培养基的绒毛，镜下清晰可见(图1a)。消化接种后24～48 h内贴壁(图1b)，贴壁的IEC呈单层生长，形状不一，大多呈多角形，细胞表面有多个突出，胞浆饱满，核为圆形或卵圆形，核仁1～2个，符合小肠上皮细胞的特征。贴壁的IEC呈单层生长，形状呈三角形或者多角形和梭形等，细胞生长良好，5～6 d形成细胞群落，9～11 d汇合成片(图1c)，细胞排列紧密，互相簇拥而形成“铺路石样”(图1d)。

图1 猪肠上皮细胞的分离、培养

3.2 体外原代培养猪IEC的增殖

其生长曲线如图2所示。由图2可知，接种后48 h细胞处于适应休眠期，然后开始进入对数生长期，在216 h后处于停滞期，细胞不再增殖。群体倍增时间约为72 h。

图2 猪IEC的生长曲线

3.3 猪IEC的鉴定

3.3.1 碱性磷酸酶的鉴定

碱性磷酸酶显色后，可以看到细胞胞质含黑色颗粒，细胞骨架清晰；90%以上的细胞呈阳性反应，如图3所示。

图3 碱性磷酸酶鉴定IEC

3.3.2 免疫学方法鉴定

免疫学方法鉴定上皮细胞角蛋白8的表达，阳性细胞呈棕黄色或棕褐色，90%以上的细胞呈阳性反应，如图4所示。

图4 免疫学方法鉴定IEC（100×）

4 讨论

位于消化管内壁的肠上皮是一种单层组织，由肠隐窝基部的干细胞不断增殖。上皮细胞和成纤维细胞之间有紧密的联系，共同被称作内胚层结构增殖单位。完整的内胚层结构增殖单位可以很好地通过细胞与细胞、细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)之间的相互作用或者信息分子的复杂信号网络来维持自身的平衡[13]。但这个平衡系统在离体组织样品中是很脆弱的，因组织突然供血不良、温度调节失衡、细胞和细胞、细胞和ECM的相互作用也会紊乱。上皮细胞和ECM联系的紊乱会导致细胞程序化的死亡，即失巢凋亡现象(anoikis)[14]。肠干细胞对失巢凋亡有高度的敏感性，这也正是肠上皮细胞原代培养很难获得成功的主要原因。常用的分离方法包括组织切块移植法、机械分离法、螯合作用和酶消化法，酶消化法分离上皮细胞的优势可以消除一些细胞和细胞之间的相互作用,尤其是上皮细胞和隐窝成纤维细胞之间的相互作用。所有酶中胶原酶因其对上皮细胞的损伤较小而使用得最多。本研究使用胶原酶分离IEC，效果良好。

细胞培养成败的一个重要因素就是防止污染，从试验材料到试验场地、用具、操作和培养保持，任何一个环节的不注意，都可能造成试验的失败。本试验选取新生的、未进食的仔猪，其肠腔内属于相对无菌环境，避免了主要的污染来源。适时传代对于培养细胞的正常生长具有重要意义。要注意观测细胞的状态，观察是否有调亡的现象发生，正常细胞铺满80%就可以考虑传代。传代过晚会影响细胞的生长甚至引起凋亡。消化时注意消化时间和消化液用量的控制，消化液以刚好覆盖瓶（孔）底为宜，镜下观测控制消化时间，最佳终止时间在60%～80%细胞收缩成圆形时。在消化细胞前将胰酶在37℃水浴中温热10 min左右，可以达到最好的消化效果，而且节省操作时间，消化后细胞很容易吹打成为单个细胞，因为容易吹打，所以对细胞的损伤小。

AKP是一种磷酸单酯键水解酶，在碱性条件下活性最强，可以水解磷酸化的糖、核酸和蛋白上的磷酸基团。小肠碱性磷酸酶是小肠分化与成熟的一类标志性酶，参与小肠的物质代谢，因此可作为IEC鉴定的标志[15]。本试验中，碱性磷酸酶鉴定呈阳性，从生化的角度证明所获得的细胞是IEC。细胞角蛋白为上皮组织的特征性抗原成分[16]，本试验选用生物素标记的细胞角蛋白抗体通过免疫学试验来鉴定猪IEC。试验结果显示小肠上皮细胞为阳性(棕色)，阴性对照不显色，从细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为IEC。综上所述，本试验通过机械分离和胶原酶消化相结合的方法，成功地在体外培养了新生仔猪IEC，为猪肠道营养建立了理想的试验模型。

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