人鼻咽癌细胞系中基质金属蛋白酶9的表达及意义*

刘 涛，谢民强

（1.广州中山大学附属第三医院 耳鼻咽喉头颈外科，广东 广州510630；2.广州南方医科大学珠江医院 耳鼻咽喉头颈外科，广东 广州510282）

鼻咽癌是中国南方常见的一种高转移性的恶性肿瘤，往往在疾病的早期即发生组织侵袭和转移，但其生物学机制仍不清楚[1]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是基底膜及细胞外间质的蛋白水解酶，能促进恶性肿瘤浸润和转移[2]。其中，MMP家族成员中的MMP9主要降解Ⅳ型胶原，使基底膜破坏，启动肿瘤细胞侵袭的起始阶段[3]。虽然有研究发现，人鼻咽癌组织中MMP9高表达可能与鼻咽癌侵袭和转移相关[4～6]，但具体机制尚不清楚。为进一步明确鼻咽癌细胞中MMP9基因在体内和体外表达有无差别，以及这种差别与鼻咽癌的侵袭有何关系，本文采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术对鼻咽癌细胞株 CNE1、CNE2、HNE1、HNE2 和 SUNE1 及CNE2、HNE1裸鼠成瘤瘤块中MMP9基因的表达进行了检测，结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

鼻咽癌细胞株：CNE1、CNE2、HNE2 均购自中山大学北校区实验动物中心细胞库，HNE1购自中南大学湘雅医学院细胞库，SUNE1购自南方医科大学肿瘤研究所。

Trizol购自Invitrogen公司，Taq酶及逆转录试剂盒（ K1621）购自Fermentas公司。浓缩型MMP9鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司。SABC试剂盒、羊抗鼠IgG及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。HRP标记羊抗鼠IgG购自KPL公司。蛋白裂解液购自PIERCE公司。免疫印迹（Western Blot）试剂盒 ECL购自Amersham公司。硝酸纤维素膜及低分子量蛋白质标志物购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人鼻咽癌细胞培养于10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、5%二氧化碳培养至细胞长满培养瓶底部70%～80%时，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 鼻咽癌细胞株中的MMP9蛋白表达的检测培养瓶内放入盖玻片，待细胞爬片融合到95%～100%时，以4%多聚甲醛固定20～30 min，采用SABC法进行细胞免疫组织化学染色，一抗为浓缩型MMP9鼠抗人单克隆抗体，1∶100稀释，具体染色步骤参照说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照。细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。

取对数生长期CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、SUNE1细胞，1×107个/mL （约50 mL培养瓶），蛋白提取：用预冷的PBS洗细胞3次，加入细胞裂解液400μL裂解细胞，冰盒上刮下细胞，4℃、10000 r/min离心10 min，收集上清，-20℃保存。Bradford比色法测定蛋白浓度定量，调节蛋白浓度一致后，行SDS-PAGE电泳。转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉37℃封闭1h，与鼠抗人MMP9一抗（1∶500稀释）4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，每次15 min，然后加入HRP标记羊抗鼠IgG（1∶5000稀释），37℃孵育1 h后，用增强型化学发光法检测蛋白质表达，胶片扫描保存。

1.2.3 鼻咽癌细胞株中的MMP9 mRNA表达的检测 收获对数生长期的鼻咽癌细胞，用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA。全部引物采用Primer3软件设计，由上海生工生物工程公司合成。引物序列和产物大小见表1。基因扩增反应体系为：2.5μL的 10×PCR 缓冲液，2μL cDNA，1μL dNTPs（2.5 mmol/L），上下游引物各 0.5μL（10 pmol/L），Taq 聚合酶 0.25μL（5U/μL），用 RNase Free dH2O加至25μL。PCR循环参数为：94℃预变性 4 min；然后 94℃变性 30 s，61℃（MMP9）/55℃（β-actin）复性 30 s，72℃延伸 30 s，30 个循环；最后72℃延伸5 min终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯观察并照相。

1.2.4 HNE1和CNE2细胞裸鼠成瘤瘤块组织中MMP9的表达 5～7周龄 BALB/c nu裸小鼠 10只，在SPF环境（中山大学实验动物中心动物实验部）中饲养，将对数生长期的人鼻咽癌HNE1和CNE2细胞分别以10×107个/mL及5×107个/mL的密度接种于裸鼠腋后背部皮下，每组5只，每只接种剂量0.2 mL。待瘤块长至直径10 mm左右后处死裸鼠，迅速解剖剥离肿瘤，以4%多聚甲醛液固定24 h，梯度酒精脱水、透明，石蜡包埋连续切片，SABC法检测组织中MMP9的表达。

2 结果

2.1 5株鼻咽癌细胞MMP9免疫组化检测结果

HNE1和SUNE1细胞中MMP9蛋白呈阳性表达，CNE1、CNE2及HNE2中未见到细胞MMP9蛋白的表达。结果见图1。

2.2 鼻咽癌细胞系中MMP9 mRNA的表达

以β-actin为内对照，应用RT-PCR方法检测了鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2 及SUNE1中MMP9 mRNA的表达。结果如图2所示，5株鼻咽癌细胞均有MMP9 mRNA表达，以HNE1和SUNE1表达较强，后者与免疫组织化学检测结果一致。

2.3 鼻咽癌细胞系中MMP9蛋白的表达

表1 PCR引物序列和产物大小

图1 MMP9在 CNE1、CNE2、HNE1、HNE2和SUNE1细胞中的表达情况（×200）

图2 RT-PCR法检测鼻咽癌细胞系MMP9 mRNA表达水平

图3 Western Blot检测鼻咽癌细胞系MMP9蛋白表达

图4 MMP9在CNE2及HNE1细胞裸鼠成瘤瘤块中的免疫组化阳性染色（×400）

Western Blot检测结果如图3所示。HNE1和SUNE1细胞中MMP9蛋白高表达，分别在92KD和83KD处检测到酶原及酶的条带。CNE1、CNE2及HNE2细胞中无明显MMP9蛋白表达。

2.4 鼻咽癌细胞株裸鼠成瘤瘤块MMP 9的免疫组化结果

HNE 1及CNE 2细胞各5只裸鼠种瘤均成功，瘤块组织中MMP 9均呈强阳性表达。结果见图4。

3 讨论

鼻咽癌是我国常见的一种恶性肿瘤，临床上易早期发生组织侵袭和淋巴结转移，探讨鼻咽癌浸润和转移机制具有非常重要的临床和理论意义。

肿瘤细胞降解基底膜和侵入下层的结缔组织是上皮性恶性肿瘤局部浸润和远处转移的关键步骤，而MMP在此过程中起重要作用。MMP是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶类，其活性异常与肿瘤侵袭能力和转移发生密切相关，恶性肿瘤细胞阳性表达者其侵袭周围组织能力明显增强，且更易发生淋巴结和血道转移，预后明显较差。在MMP家族成员中，MMP 9主要降解Ⅳ型胶原。其中，Ⅳ型胶原是构成B M的主要支架和成分，肿瘤细胞的浸润和转移首先须发生B M的降解，即Ⅳ型胶原破坏就意味着肿瘤细胞的浸润或即将发生浸润。已有研究发现，MMP 9在多种恶性肿瘤中具有高表达，与肿瘤侵袭转移密切相关[7，8]。

国内外学者研究认为，MMP 9有促进鼻咽癌细胞侵袭转移的能力，可引起颈部淋巴结转移[3～6]。近来已有学者发现，MMP 9与鼻咽癌颅内侵犯密切相关[9]。

然而，MMP 9在鼻咽癌细胞系中表达尚无文献报道。本文采用细胞免疫组化、Western Blot和RT-PCR方法，检测了MMP 9在鼻咽癌细胞系中MMP 9的表达。结果显示，在鼻咽癌细胞系中，有HNE1及SUNE1多株细胞MMP 9较强表达。

通过不同的鼻咽癌细胞HNE1和CNE2裸鼠成瘤研究我们还发现，HNE1细胞在体内外MMP 9蛋白表达均较强。CNE2细胞MMP 9蛋白表达阴性，而该细胞裸鼠成瘤后表达强阳性，推测与体内外环境改变有关。通常在科研工作中，选择各种细胞进行蛋白质水平的实验是很常见的工作。但研究发现，细胞表型受到周围微环境，特别是周围细胞的细胞相互作用的影响，培养细胞可能因微环境改变或失去周围细胞的相互作用而使基因表型发生改变。在细胞水平获得的结果并不能完全代表体内的情况，所以在细胞水平取得的结果，如果能在组织中获得进一步的验证，其结果将更为可靠。本文通过MMP9蛋白表达较强的HNE1细胞和MMP9蛋白表达阴性的CNE2细胞裸鼠体内成瘤瘤块免疫组化方法发现，两者均有MMP9的强表达，进一步说明MMP9在鼻咽癌细胞系中的表达，可能在鼻咽癌浸润转移中起着重要的作用。

综上，本文初步研究得出MMP9在鼻咽癌细胞系中具有高表达，其可能参与鼻咽癌的侵袭转移等恶性生物学行为。通过探讨鼻咽癌细胞系MMP9的表达及其改变与鼻咽癌成瘤性侵袭转移等生物学行为的关系研究，为今后研究鼻咽癌的发生及侵袭转移等机制并进行干预打下基础。

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