小檗碱对EB病毒DNA复制的抑制作用

黄大毛，孟菁菁，谢春蕾，吴尚辉，顾焕华，唐发清

（中南大学 1.湘雅医院检验科，湖南 长沙 410008；2.湘雅医学院细胞中心，湖南 长沙 410078）

小檗碱（Berberine，BBR）是毛莨科植物黄连（Coptis chinensis Franch）根茎提取的主要的有效成分，分子式为[C20H18NO4]+，分子量为336.37。BBR不仅具有广谱的抗菌消炎的药理作用，而且具有广泛的抗肿瘤效应。研究发现，在鼻咽癌的防治中，BBR具有重要作用。BBR或含BBR的药物能够降低鼻咽癌高危人群EBV相关抗体滴度或使其转为阴性[1，2]，抑制 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潜伏感染，降低鼻咽癌的发病率[3]。为进一步明确BBR抑制EB病毒潜伏感染疗效和阐明BBR作用的机制，本文以带EB病毒的Raji细胞为细胞模型，研究小檗碱对EB病毒复制的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 Raji细胞（ATCC CCL86）购自中南大学分析测试中心细胞生物研究室。Raji细胞是携带和自主复制EBV基因的人Burkitt's淋巴瘤细胞，悬浮生长，聚集成团，体积较大，折光性较强。

1.1.2 主要仪器和试剂 Mx3000p型荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司。盐酸小檗碱（Berberine Chloride），C20H18ClNO4购自 Sigma公司（633-65-8），MTT试剂购自 Sigma公司（57360-69-7）。Hyclone改良型RPMI1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司。病毒DNA小剂量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs购自广州达安基因股份有限公司。其它仪器试剂均由中南大学现代分析测试中心细胞生物研究室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 Raji细胞株接种到含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI1640培养基，37℃，5%二氧化碳条件下培养，2～3 d传代一次，待细胞处于对数生长期进行实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制试验 取对数生长期Raji细胞，用含药培养基调整细胞浓度为104个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，同时设置调零孔（培养基），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液），每组设置4个平行孔，于37℃，5%二氧化碳条件下培养48 h后，每孔加入20μL MTT溶液，轻轻摇匀，在37℃，5%二氧化碳培养箱中培养4h。1000 r/min离心10 min，弃去上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在490 nm波长下测量各孔的吸光度值。

1.2.3 巢式荧光定量PCR检测EBV-DNA ①标准品的制备：取Raji细胞冻存液进行细胞计数，根据文献[4]报道的每个Raji细胞约含有50个拷贝的EBV-DNA进行计算，得到Raji细胞冻存液中E BV-DNA的浓度为2.9×105拷贝/μL。②巢式荧光定量PCR检测EBV-DNA：使用病毒DNA小量抽提试剂盒从培养的Raji细胞中抽提病毒DNA，操作步骤按试剂盒说明书（稍加改进）进行。选择EB病毒DNA全序列20206～20426位为外扩增区，20279～20343位为内扩增区，荧光探针在内扩增区内20299～20318位。外扩增引物：上游引物为5'-TC AAAACTTTAGAGGCGAATGG-3'，下游引物为5'-CTGAGAAGGTGGCCTAGCAAC-3'，扩增片段长度为221 bp。内扩增引物：上游引物为5'-CCA GGAAGCGGGTCTATGG-3'，下游引物序列为5'-GGCTTATTCCTCTTTTCCCCT CTA-3'，扩增片段长度为 65 bp。荧光探针：Taqman探针序列5'-FAM-TGGCTGCGCTGCTGCTATC-TAMRA-3'。扩增引物、探针由广州达安基因股份有限公司设计合成。标准品的外扩增反应体系及反应条件：将Raji细胞抽提的EBV-DNA稀释成一定浓度梯度（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝 /50μL反应体系）。50μl反应体系：5×定性缓冲液10μL，Taq DNA聚合酶1μL，dNTPs 1μL，上游外引物1μL，下游外引物1μL，标准品nμL（n为根据浓度计算的体积0.40），加水补至50μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 个循环；72℃ 7 min。样品的外扩增反应体系及反应条件：50μL反应体系：5×定性缓冲液 10μL，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTPs 1μL，上游外引物 1μL，下游外引物1μL，模板10μL，加水补至50μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃ 7 min。内扩增反应体系及反应条件：标准品与样品相同。50μl反应体系：5×定量缓冲液 10μL，Taq DNA聚合酶 1μL，dNTPs 1μL，上游内引物1μL，下游内引物1μL，Taqman探针1μL，外扩增产物5μL，加水补至50μL。反应条件：95℃5 min；95℃ 45s，55℃ 45 s，40 个循环。

1.3 统计学处理

运用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，数值用均数±标准差（）表示，两个均数比较采用t检验以及独立样本T检验。

2 结果

2.1 MTT法检测BBR对Raji细胞的细胞无毒性浓度

为观察BBR对鼻咽癌细胞生长的影响，采用MTT法分析不同浓度（100、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0μmol/L）BBR 处 理Raji细胞后细胞增殖情况。结果显示，在BBR浓度分别为 10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 μmol/L时，细胞数与空白组比较无明显差异（P＞0.05），而 BBR 浓度为 100、80、40、20μmol/L时，细胞数明显少于对照组（P＜0.05），且细胞数随BBR浓度的增高而减少（图2），表明高浓度（10μmol/L以上）BBR对Raji细胞增殖生长有明显的抑制作用。鉴于在10μmol/L以下浓度的BBR对Raji细胞生长增殖没有明显影响，因而BBR对Raji细胞的细胞无毒性浓度为0～10μmol/L。

图1 BBR分子结构

图2 BBR对Raji细胞的抑制作用

2.2 不同浓度BBR对Raji细胞形态的影响

为进一步确证细胞无毒性浓度的BBR对Raji细胞生长的影响，用倒置显微镜观察不同浓度（40、10、1.25μmol/L）BBR处理的Raji细胞形态。结果表明，用细胞无毒性浓度的BBR（10、1.25μmol/L）处理的Raji细胞，与对照组细胞一样呈悬浮生长，生长良好，细胞呈圆形、体积较大、折光性强。当BBR浓度为40μmol/L时，细胞数明显少于对照组，细胞散在生长且未聚集成团，体积略小，折光性较低（图3）。

图3 不同浓度BBR处理后的Raji细胞形态

2.3 巢式荧光定量PCR检测EBV-DNA表达

2.3.1 建立标准曲线 用稀释成不同浓度的Raji细胞进行扩增反应，反应结束时得出扩增的动力学曲线（图4）及荧光定量标准曲线（图5）。

图4 标准品扩增曲线

图5 标准曲线

图6 不同浓度BBR处理Raji细胞后EBV-DNA拷贝数的变化

2.3.2 不同浓度BBR处理的Raji细胞中EBV-DNA表达 运用巢式荧光定量PCR方法分别检测不同浓度 BBR（40、10、1.25 和 0μmol/L）处理的Raji细胞中EBV-DNA表达，根据已建立的标准曲线计算不同药物浓度处理的Raji细胞中EBV-DNA的拷贝数。结果显示，细胞无毒性浓度的BBR（10、1.25μmol/L）处理 Raji细胞后，EBV-DNA的拷贝数明显低于未经药物处理组（P＜0.05），见图6。

3 讨论

鼻咽癌是我国南方一种常见的头颈部恶性肿瘤，鼻咽癌确切发病机制尚不十分明确，目前无法进行鼻咽癌的一级预防。研究表明，EBV的感染与鼻咽癌的发生、发展密切相关[5，6]，EB病毒不仅参与了鼻咽癌各阶段，而且EB病毒潜伏感染的程度，如EB病毒相关抗体滴度和DNA拷贝数，间接提示鼻咽癌疾病状态，尤其是鼻咽癌高危人群的预防方面，已经将降低和清楚EB病毒潜伏感染作为鼻咽癌高危人群预防一项重要指标[7，8]。

BBR是一种异喹啉生物碱，为白毛茛、黄柏、黄连等植物药的主要成分，具有抗菌、抗感染、解热镇痛等作用[9]。近年来，BBR又被证实具有抗肿瘤作用[10，11]。BBR 抗肿瘤机制研究表明，BBR通过抑制COX-2[12]、DNA拓扑异构酶[13]以及与DNA形成复合物[14，15]等方式，抑制肿瘤细胞的 DNA、RNA和蛋白质合成；通过抑制激活蛋白-1（AP-1）的活性，阻断肿瘤转移相关的信号通路等，最终抑制肿瘤转移[16]。在我们的前期研究工作中，用BBR或含BBR的中药复方进行鼻咽癌高危人群预防[1]，发现其能降低鼻咽癌高危人群EBV相关抗体滴度或使其转为阴性[2]，进而抑制EBV潜伏感染，降低鼻咽癌的发病率[3]。在增强鼻咽癌患者放射治疗的敏感方面，BBR的中药复方降低鼻咽癌患者EBV相关抗体，增强鼻咽癌放疗的敏感性[17]。由此，我们推测在BBR可能干预EBV病毒复制，进而降低鼻咽癌组织或者血浆中EBV-DNA的含量。

本文采用巢式-荧光定量PCR方法检测BBR处理Raji细胞后EBV-DNA拷贝数，结果发现，BBR能够明显抑制Raji细胞中EBV-DNA复制，且呈药物浓度依赖性。此结果提示，BBR也可能通过抑制鼻咽癌细胞EBV-DNA的复制降低鼻咽癌的发生。在本项目研究中，为排除因药物毒性作用而对细胞生长产生影响，我们采用MTT法筛选BBR的无细胞毒性浓度，该浓度对细胞生长增殖没有明显毒性，因而我们认为BBR对Raji细胞EBV-DNA复制抑制作用不是因为其本身毒性作用影响细胞生长，而是小檗碱的药理学作用，其具体作用分子机制有待进一步研究。

BBR抑制EBV-DNA的复制，因而可以阻断EBV致癌作用，降低鼻咽癌的发生率。另外，BBR在治疗过程中毒性较小以及价格低廉，因而，在鼻咽癌的一级预防应用中有潜在临床应用前景。

[1]唐发清,谌兵来,田道法,等.益气解毒片对鼻咽癌细胞基因表达的影响[J].湖南中医学院学报,1998,18(2):14-15.

[1]TANG FQ,CHEN BL,TIAN DF,et al.The Inhibitory effect of yiqi jiedu pian on genes expression in nasopharyngeal carcinoma cell.Journal of Hunan College of Traditional Chinese Medicine,1998,18(2):14-15.Chinese

[2]周小军,田道法,何健生,等.益气养阴、清热解毒法治疗EB病毒感染者41例[J].中医研究,2005,18(12):16-18.

[2]ZHOU XJ,TIAN DF,HE JS,et al.Therapy of EB virus infected patients by supplementing qi,nourishing yin and removing heat and toxic materials.Traditional Chinese Medicinal Research，2005,18(12):16-18.Chinese

[3]田道法,唐发清,陈协云,等.益气解毒颗粒对鼻咽癌高危人群EB病毒感染活性抑制作用的临床观察 [J].湖南中医学院学报,2000,20(3):47-49.

[3]TIAN DF,TANG FQ,CHEN XY,et al.A Clinical Observation on the Inhibitory Effect of Yiqijiedu Granules to the Infection Activity ofEBV in Population Highly Susceptible to NPC.Journal of Hunan College of Traditional Chinese Medicine,2000,20(3):47-49.Chinese

[4]TAKAKUWA T,LUO WJ,HAM MF,et al.Integration of Epstein-Barr virus into chromosome 6q15 of Burkitt lymphoma cell line (Raji)induces loss of BACH2 expression[J].Am J Pathol,2004,164(3):967-974.

[5]AFQIR S,ISMAILI N,ERRIHANI H.Concurrent chemoradiotherapy in the management of advanced nasopharyngeal carcinoma:current status[J].J Cancer Res Ther,2009,5(1):3-7.

[6]ZOU P,KAWADA J,PESNICAK L,et al.Bortezomib induces apoptosis of Epstein-Barr virus (EBV)-transformed B cells and prolongs survival of mice inoculated with EBV-transformed B cells[J].J Virol,2007,81(18):10029-10036.

[7]罗耀凌,欧国萍,池沛冬,等.联合检测EB病毒相关抗体和抗原对诊断鼻咽癌的价值[J].癌症,2009,28(1):96-99.

[7]LUO YL,OU GP,CHI PD,et al.Combined determination of Epstein-Barr virus-related antibodies and antigens for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.Chinese Journal of Cancer,2009,28(1):96-99.Chinese

[8]FACHIROH J,PRASETYANTI PR,PARAMITA DK,et al.Dried-blood sampling for epstein-barr virus immunoglobulin G(IgG)and IgA serology in nasopharyngeal carcinoma screening[J].J Clin Microbiol,2008,46(4):1374-1380.

[9]WEI P,JIAO L,QIN LP,et al.Effects of berberine on differentiation and bone resorption of osteoclasts derived from rat bone marrow cells[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao,2009,7(4):342-348.Chinese

[10]李 波,朱维良,陈凯先.小檗碱及其衍生物的研究进展[J].药学学报,2008,43(8):773-787.

[10]LI BO,ZHU WL,CHEN KX,et al.Advances in the study of berberine and its derivatives.Acta Pharmaceutica Sinica,2008,43(8)：773-787.Chinese

[11]CHOI MS,OH JH,KIM SM,et al.Berberine inhibits p53-dependent cell growth through induction of apoptosis of prostate cancer cells[J].Int J Oncol,2009,34(5):1221-1230.

[12]KUO CL,CHICW,LIU TY.Modulation of apoptosisby berberine through inhibition of cyclooxygenase-2 and Mcl-1 expression in oral cancercells[J].In Vivo,2005,19(1):247-252.

[13]KOBAYASHI Y,YAMASHITA Y,FUJII N,et al.Inhibitors of DNA topoisomerase I and II isolated from the Coptis rhizomes[J].Planta Med,1995,61(5):414-418.

[14]LETASIOV S,JANTOV S,CIPK L,et al.Berberine-antiproliferative activity in vitro and induction of apoptosis/necrosis of the U937 and B16 cells[J].CancerLett,2006,239(2):254-262.

[15]SLANINOVA I,TABORSKA E,BOCHORAKOVA H,et al.Interaction of benzo[c]phenanthridine and protoberberine alkaloids with animal and yeast cells[J].Cell Biol Toxicol,2001,17(1):51-63.

[16]MITANI N,MURAKAMI K,YAMAURA T,et al.Inhibitory effect of berberine on the mediastinal lymph node metastasis produced by orthotopic implantation of Lewis lung carcinoma[J].Cancer Lett,2001,165(1):35-42

[17]YOUN MJ,SO HS,CHO HJ,et al.Berberine,a natural product,combined with cisplatin enhanced apoptosis through a mitochondria/caspase-mediated pathway in HeLa cells[J].Biol Pharm Bull,2008,31(5):789-795.Chinese