紫丁香蘑原基诱导合成培养基初探

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(武汉生物工程学院生物工程系，湖北 武汉 430415)

许多野生食用菌，尤其是草腐菌和菌根菌，都只能培养其菌丝体，却不能成功地栽培出子实体。因此，对子实体诱导培养基的研究格外重要。

草腐菌子实体的发生对营养的要求复杂多样，且与环境因子以及环境微生物的关系密切，目前少数报道的草腐菌的子实体诱导培养实验，通常是在天然或半合成培养基上进行的[1]。由于这些培养基的准确成分不定，对草腐食用菌生命活动规律的研究造成了一定的限制。在诸多培养基中，合成培养基因其成分明确，成为培养基设计初期最好的生理研究和环境因子筛选平台。此外，以无机支持物吸附液体培养基是诱导子实体发生的较好方法[2]。因此，作者利用珍珠岩吸附液体合成培养基的方法，对紫丁香蘑原基诱导合成培养基进行了成分优化，以筛选出一种适于诱导其子实体原基发生的合成培养基，为进一步研究紫丁香蘑的生理学问题、探讨其子实体原基发生机理提供实验平台。

1 实验

1.1 菌种

紫丁香蘑(Lepistanuda)子实体采自中国科学院武汉植物园，取菌肉于PDA培养基[3]上组织分离。无菌检查后4℃恒温保藏。

1.2 培养基

平板培养基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB120 mg，琼脂 4 g，水1000 mL，10%NaOH调pH值至6.4[3]。

原基诱导合成培养基[4～6]：(1)速效碳源(5 g·L-1单/双糖)，诱导碳源(25 g·L-1多糖)。(2)氮源(2 g·L-1复合氨基酸)，配制为贮备液使用，每1000 mL培养基添加量78.7 mL，贮备液具体成分：异亮氨酸0.87 g，亮氨酸1.18 g，盐酸赖氨酸1.74 g，甲硫氨酸1.12 g，苯丙氨酸1.03 g，苏氨酸1.12 g，色氨酸0.43 g，盐酸精氨酸3.50 g，缬氨酸0.95 g，甘氨酸3.23 g，盐酸组氨酸0.98 g，酪氨酸0.165 g，丙氨酸5.33 g，脯氨酸2.90 g，丝氨酸2.90 g，N-乙酰-L-半胱氨酸0.22 g，谷氨酸2.28 g，蒸馏水1000 mL。(3)无机盐(mg·L-1)：KH2PO43000，MgSO4·7H2O 1500，CaCl2·2H2O 40，需将氯化钙和硫酸镁分开灭菌后无菌混合。(4)微量元素及铁盐：为植物组织培养基(MS培养基)中MSⅡ微量元素、MSⅢ铁盐，MSⅡ贮备液(mg·L-1)：KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025,额外添加：NiCl2·6H2O 0.08，SnCl2·2H2O 0.038;MSⅢ贮备液(mg·L-1)：Na2EDTA 37.3，FeSO4·7H2O 27.8[7]。(5)生长因子液(mg·L-1)：i-肌醇100，盐酸硫胺素 0.1，盐酸吡哆醇 0.5，烟酸 0.5，泛酸钠 0.1，核黄素 0.1，对氨基苯甲酸0.1，生物素 0.03，叶酸 0.01，氰钴胺 0.01，需要使用助溶剂并过滤灭菌。(6)刺激出菇的有机酸钠盐(0.1 g·L-1)和子实体发生刺激物(1×10-5g·L-1)。

1.3 方法

1.3.1 合成培养基初筛及复筛

合成培养基初筛：选取单/双糖(5 g·L-1)、子实体发生刺激物(1×10-5g·L-1)、两者交互作用、多糖(25 g·L-1)和有机酸钠盐(0.1 g·L-1)分别作为因子A、B、C、D和E， 设计L16(45)初筛正交实验，因素与水平见表1。

表1 培养基初筛正交实验因素与水平

合成培养基复筛：依据培养基初筛正交实验的结果，设计L9(34)正交实验进行培养基复筛，进一步优化培养基，因素与水平见表2。初筛实验的最优培养基作为复筛实验方案之一，可作为参照，因此不另设对照。

表2 培养基复筛正交实验因素与水平

1.3.2 培养基的配制

培养基支持物：珍珠岩用10%NaOH和10%HCl各浸泡24 h后，蒸馏水洗至中性并浸泡48 h，150℃烘干备用。

培养基配制与灭菌：取10 g珍珠岩装入250 mL三角瓶中，称取诱导碳源与珍珠岩搅拌均匀。各培养基成分加入顺序依次为速效碳源及有机酸钠盐贮备液、无机盐(氯化钙除外)、MSⅡ贮备液、 MSⅢ贮备液。将三角瓶以一层纱布覆盖两层玻璃纸封口，121℃灭菌30 min，冷却后再加入过滤灭菌的生长因子贮备液、氯化钙、复合氨基酸贮备液、子实体发生刺激物。补足蒸馏水。

1.3.3 种子制备及接种

取紫丁香蘑保藏斜面于25℃下活化48 h后，接入PDA平板中，24℃培养10 d，将培养物剥离琼脂并以灭菌蒸馏水冲洗3次，匀浆5 s，悬浮于无菌蒸馏水中，立即以破口吸量管吸取1 mL菌丝体接种到诱导培养基上。将培养物放置在24℃、80%RH、完全黑暗的条件下培养30 d。待大多数菌丝长满培养基表面后，移置16℃、100%RH、60 Lx的条件下，刺激出菇[8]。

1.3.4 子实体原基显微形态观察

以常规染色检查原基的显微结构，凭借其是否具有规则结构作为与无规则的菌丝团块结构区分的依据[9]，并通过组织化学染色方法，以普通气生菌丝为参考，确证在原基及其周边菌丝中存在糖原的积累，以验证其是否为子实体原基。原基制片采用石蜡切片法，使用FA固定液，切片厚度10 μm，瑞氏染色剂染色后脱水，透明，以甘油胶冻封片[10]，镜检。糖原检测采用过碘酸-Schiff氏染色法[11]。

2 结果与讨论

2.1 原基结构

35 d左右，原始原基结构开始出现于容器壁上，肉眼观察呈白色的球状或半球状，直径0.5～4 mm。质地疏松，透过灯光可以发现其中有暗色致密的核心，绳索状菌丝贯穿或附于其上。

在低倍镜下可见原基的纵切面与横切面都由大量分支菌丝构成且明显分为3层，外层的疏松菌丝包围着内层较致密的菌丝，核心是扭结在一起的深色菌丝。扭结的核心伸出一条或数条菌丝索状结构。任何层次的菌丝都具有多量索状联合。图1为6#复筛培养基培养的子实体放大600倍的显微结构，图片右下角为手绘结构示意图。

图1 子实体半球状原基的显微照片

仅从形态上来说，此结构与李荣春[12]以低温扫描电镜观察双孢蘑菇原基起源点结构十分类似，是紫丁香蘑的原基或原基起源点。组织化学检查在此结构中发现了糖原的存在；生长在PDA培养基或合成培养基尚未产生原基的菌丝中没有大量的糖原。由于缺乏定量的检测手段，不能衡量二者的差异。

2.2 培养基初筛及复筛实验结果

经过30 d的24℃恒温无光培养和15 d的出菇刺激，各培养基初筛结果见表3、表4。

表3 培养基初筛正交实验结果与分析

表4 培养基初筛正交实验结果方差分析

从表3、表4可知，最优培养基为A2B1D3E4(5#)或A2B2D3E4，与Hayes等[14]的双孢蘑菇子实体诱导培养基非常接近。就各因子的影响程度而言，D>A >C>B=E，且只有因子D的影响达到了显著水平，可以看出多糖很可能是诱导子实体原基发生的决定性因素[15]。双孢蘑菇的菌丝体营养生长和生殖生长的碳源是木质素和纤维素，而紫丁香蘑菌丝体营养生长和生殖生长的最适碳源是淀粉[16]和糊精，二者相差很大。本研究也发现环磷腺苷和茶碱对紫丁香蘑子实体原基的诱导并没有特殊影响。邱龙新[17]对灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)的研究中，在培养基中添加环磷腺苷(cAMP)并不能诱导菌丝体产生原基和子实体，这说明cAMP不是鬼伞双核体菌丝生长和子实体形成所必需的直接信号，因此，复筛中为节约成本不再添加子实体发生刺激物。

培养基复筛实验所有组合经过30 d、24℃的无光培养，再经过15 d出菇刺激，开始出现原基。结果见表5、表6。

表5 培养基复筛正交实验结果与分析

表6 培养基复筛正交实验结果方差分析

其它的因子在方差分析中效应均不明显，其中乙酸钠的效应尽管在方差分析中不显著，但仍与Hayes的研究结果一致。虽然培养基中没有添加环磷腺苷或茶碱，但仍然有多量的子实体原基发生，可见邱龙新和Wood[2]的结论对紫丁香蘑一样适用。

本次实验并没有观察到所诱导出的原基继续发育为子实体，尽管从接种到培养结束的时间已经大大超过在人工栽培条件下紫丁香蘑由菌丝体发育为完整子实体的时间(60 d)。这个问题有待进一步研究。

3 结论

筛选出用于紫丁香蘑原基诱导的合成培养基。合成培养基由复合碳源(木糖+糊精)、复合氨基酸氮源、无机盐、MS培养基中的微量元素及铁盐、生长因子、出菇刺激物等6部分构成，以珍珠岩为支持物。优化后培养基中含有5 g·L-1木糖、25 g·L-1糊精、0.1 g·L-1乙酸钠。在此培养基上，紫丁香蘑菌丝经24℃无光培养30 d、再经16℃弱光刺激15 d后可产生83个原基。紫丁香蘑菌丝体营养生长和生殖生长的最适碳源是淀粉和糊精。菌丝体营养生长向生殖生长转化的过程中，多糖起了决定性的作用，是诱导子实体原基形成的关键因素，而cAMP并不是双核体菌丝生长和子实体形成所必需的直接信号。

参考文献：

[1] 杨庆尧.食用菌生物学基础[M].上海：上海科学技术出版社，1981：129-181.

[2] Wood D A.Studies on primordium initiation inAgaricusbisporusandAgaricusbitorquis(Syn，edulis)[J].Mushroom Science(Part 1)，1979,10(Part 1)：665-686.

[3] 杨新美.食用菌研究法[M].北京：中国农业出版社，1998：30-234.

[4] Gary F Leatham. Synthetic mediums ofLentinusedodes[J]. Mycologica， 1983，75(5)：905-908.

[5] Oyama Y,Yoshida T,Taguchi H.The artificial cultivation of mycorrhiza-forming basidiomycetes[J].Mushroom Science,1976,9(Part1):719-731.

[6] 杨国良.蘑菇生产全书[M].北京：中国农业出版社，2006：14-125.

[7] 李浚明，朱登云.植物组织培养教程(第三版)[M].北京：中国农业出版社，2006：14-125.

[8] 福岛县林业试验场(日)，王波，译.紫丁香蘑的栽培研究《特產情報》[J].1988，(3)：63-65.

[9] 李荣同，包水明，陈传红，等.菌核侧耳子实体分化过程中的解剖学研究[J].吉林农业大学学报，2005，27(2)：146-148.

[10] 郑国锠.生物显微技术[M].北京：高等教育出版社，1978：20-140.

[11] 张淑波，康文喜.糖原染色PAS法的改良[J].海军医学杂志，2004，25(4)：384.

[12] 李荣春.双孢蘑菇子实体原基形成的超微结构研究[J].云南农业大学学报，2001，16(4)：277-278.

[13] 李春喜，王文林.生物统计学(第三版)[M].北京：科学出版社，2005：87-185.

[14] Hayes W A，Randle P E，Last F T.The nature of the microbial stimulus affecting sporophore formation inAgaricusbisporus(Lange) Sing[J].Ann Appl Biol，1969，64(1)：177-187.

[15] 马艳弘，张福元.食用菌发育机理研究进展[J].宁夏农学院学报，2004，25(3)：63-67.

[16] 申慧彦，刘朝贵.花脸蘑菌丝营养特性的研究[J].食用菌，2003，(3)：5-6.

[17] 邱龙新.环腺苷酸在灰盖鬼伞子实体发育中的效用研究[J].微生物学通报，2000，27(2)：125-128.