大孔吸附树脂分离纯化追风伞总黄酮的研究

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(贵州大学生化营养研究所，贵州 贵阳 550025)

追风伞(LysimachiaparidiformisFranch.var.Stenophylla Franch.)系报春花科植物狭叶落地梅的全草或根，主要分布于湖南、四川、贵州等地。追风伞多以全草入药，有祛风通络、活血止痛等功效，具有较高的药用价值[1,2]，其中黄酮类成分含量丰富[3]。

大孔吸附树脂是一种人工合成的具有多孔立体结构的聚合物吸附剂，性能优良，已在医药领域得到广泛应用，尤其是可用于纯化中药的有效成分[4，5]。研究表明，大孔吸附树脂用于黄酮类化合物的提取分离、精制纯化效果较好[6～8]，但目前尚未见将其用于追风伞中总黄酮的分离纯化。作者在此采用大孔吸附树脂对追风伞总黄酮进行分离纯化，优化了工艺条件，拟为追风伞资源的开发利用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

追风伞全草购于贵州省贵阳市花果园药材市场。

芦丁对照品(批号0080-9705)，中国药品生物制品检定所；D101、H103、D4020、NKA-9、S-8、X-5、AB-8型大孔吸附树脂，天津南开大学化工厂；其它试剂均为分析纯。

TU-1901型紫外分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；1004型电子分析天平，上海天平仪器厂；98-1-B型电子调温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；GZX-9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱，上海博达实业有限公司医疗设备厂。

1.2 样品制备及测定方法

1.2.1 供试品溶液的制备

取追风伞干品粗粉100 g，依次加入12 BV、10 BV、8 BV的50%乙醇，加热回流提取，每次3 h，合并提取液，滤过。滤液减压回收乙醇至无醇味。浓缩液加水稀释，静置，抽滤除去不溶性物质，滤液再次浓缩，即得追风伞供试品溶液，冷藏保存备用。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品23.50 mg，置100 mL容量瓶中，加入适量60%乙醇溶液超声溶解，稀释至刻度，摇匀，得标准溶液。精密量取标准溶液0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加60%乙醇至6 mL；各加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min；各加10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，放置6 min；各加4% NaOH溶液10 mL；最后各加60%乙醇至刻度，摇匀，静置15 min，用紫外分光光度仪在500 nm波长处测定吸光度。以吸光度值(A)对浓度(c)绘制标准曲线，拟合线性回归方程为：A=0.01076c+0.0019，R=0.9999，线性范围为0～56.4 μg·mL-1。

1.2.3 样品的测定

取一定量待测供试品溶液于25 mL容量瓶中，按1.2.2方法测定吸光度，计算供试液中总黄酮的含量。

1.3 大孔吸附树脂对追风伞总黄酮的静态吸附实验

1.3.1 大孔吸附树脂预处理

用95%乙醇浸泡树脂24 h，使其充分溶胀，除去上浮树脂碎片和杂物，湿法装柱，用95%乙醇以适当流速通过树脂柱，洗至流出液与蒸馏水(1∶5)混合无白色混浊现象，然后用大量蒸馏水洗至无醇味，备用。

1.3.2 大孔吸附树脂的静态吸附量测定

精确称取1.0 g预处理好的大孔吸附树脂于具塞磨口锥形瓶中，加入总黄酮浓度为1.860 mg·mL-1的追风伞供试液50 mL，于室温下150 r·min-1振荡24 h，充分吸附后，过滤并测定滤液中总黄酮浓度，按式(1)、式(2)分别计算各树脂的静态吸附量(Q，mg·g-1)和吸附率(E)。

(1)

(2)

式中：c0为初始浓度，mg·mL-1；ce为平衡浓度,mg·mL-1；V1为原溶液体积，mL；m为树脂质量，g。

1.3.3 大孔吸附树脂的解吸率测定

将吸附饱和的树脂滤出，吸干表面水分，加入80%(体积分数)乙醇溶液50 mL，于室温下150 r·min-1振荡24 h，充分解析后，过滤并测定滤液中总黄酮浓度，按式(3)、式(4)分别计算解吸率(D)与回收率(P)。

(3)

(4)

式中:cx为解吸溶液浓度,mg·mL-1；V2为解吸溶液体积，mL。

1.4 大孔吸附树脂对追风伞总黄酮的动态吸附实验

1.4.1 动态吸附曲线的绘制以及动态饱和吸附量的测定

将一定浓度的追风伞供试液通过装有10.0 g已预处理大孔吸附树脂的层析柱，分段收集流出液，每10 mL收集1份，共收集36份，测定每段收集液中总黄酮的浓度，当流出液中总黄酮浓度(c)与初始样品液中总黄酮浓度(c0)基本趋于一致时停止上样，以c/c0对收集时间(t)绘制动态吸附曲线。

用少量蒸馏水冲洗层析柱，使树脂床中的上样液完全流出，合并流出液，测定流出液体积以及总黄酮的浓度。然后静置20 min，再用大量蒸馏水冲洗树脂，直至流出的水洗液接近无色，收集水洗液，测定水洗液体积和总黄酮的浓度。计算树脂动态饱和吸附量。

动态饱和吸附量=(上样液中总黄酮浓度×上样液体积-流出液中总黄酮浓度×流出液体积-水洗液中总黄酮浓度×水洗液体积)/湿树脂质量

1.4.2 动态吸附和动态解吸实验

称取10.0 g已预处理的树脂，湿法装柱。将一定浓度的追风伞供试液通过树脂柱，测定流出液中总黄酮的浓度，以总黄酮吸附量、回收率为指标考察上样液的浓度及流速等因素对树脂吸附性能的影响；将一定体积分数的乙醇通过装有已吸附样品的树脂柱，测定不同洗脱条件下洗脱液中总黄酮的浓度，以总黄酮回收率、解吸率为指标考察洗脱剂体积分数及其用量等因素对树脂解吸性能的影响，从而筛选出树脂动态吸附和解吸的最佳工艺参数。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的静态吸附与解吸结果

选择7种不同表面性质(树脂的极性和空间结构)的树脂对样品溶液进行吸附处理，测其静态吸附量和解吸率，结果见表1。

表1 不同大孔吸附树脂的静态吸附量和解吸率

由表1可知， 7种树脂对追风伞总黄酮的吸附容量以及解吸性能存在差异。其中，S-8型树脂易吸附，但解吸率太低，不适用于分离；D101型树脂有较大的静态吸附量，同时也较容易解吸附，表现出较好的综合吸附纯化能力。综合分析，选择D101型大孔吸附树脂进行动态吸附实验。

2.2 D101型大孔吸附树脂的动态吸附结果

2.2.1 动态吸附曲线(图1)

图1 D101型大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附曲线

由图1可见，当吸附时间达到150 min(即收集液体积达到300 mL)左右时，D101型大孔吸附树脂对追风伞总黄酮的吸附已经基本趋向饱和。

2.2.2 动态饱和吸附量

实验中，上样液浓度为3.286 mg·g-1时，流出液和水洗液中的总黄酮量为186 mg，D101型大孔吸附树脂的动态饱和吸附量为80.05 mg·g-1，与其静态吸附量存在一定的差异，有待进一步研究。

2.2.3 上样液浓度的确定

取已预处理的D101型大孔吸附树脂10.0 g，湿法装柱，将不同浓度的追风伞提取液，以不同体积、相同流速上样。测定吸附后溶液中总黄酮浓度，计算吸附量。适量水洗后，用70%乙醇洗脱完全，分别收集洗脱液测定总黄酮浓度，计算回收率，结果见表2。

表2 上样液浓度对总黄酮吸附量和回收率的影响

由表2可知，当上样液总黄酮浓度为1.839 mg·mL-1时，D101型大孔吸附树脂对追风伞总黄酮吸附量最大，回收率也最高。因此，选择适宜的上样液总黄酮浓度为1.839 mg·mL-1。

2.2.4 上样流速的确定

将追风伞提取液通过D101型大孔吸附树脂柱，以相同体积、不同流速进行动态吸附，测定吸附后溶液中总黄酮浓度，计算吸附量。适量水洗后，用70%乙醇洗脱完全，收集洗脱液测定吸光度，考察不同上样流速下树脂的吸附效果和产品的回收率，结果见表3。

表3 上样流速对总黄酮吸附量和回收率的影响

由表3可知，上样流速越大，树脂泄漏越早，其吸附量相应下降。原因可能是在吸附动态平衡过程中，相同的吸附速度下加快流速，则吸附时间相对缩短，从而影响了树脂的吸附效果；而放缓上样流速，固然可提高其吸附量，但却延长了达到饱和吸附所需时间，也会影响工作效率。综合考虑，选择上样流速为2.0 mL·min-1左右较为合适。

2.2.5 洗脱剂体积分数的确定

将追风伞提取液通过D101型大孔吸附树脂柱，以相同流速进行动态吸附，然后用水洗脱至洗脱液近无色，再分别用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，回收乙醇，蒸干，定容于100 mL容量瓶后测定吸光度，计算解吸率、回收率以及总黄酮纯度，结果见表4。

表4 洗脱剂体积分数对总黄酮解吸率、回收率及纯度的影响

由表4可知，90%乙醇洗脱产物的解吸率与回收率最高，70%乙醇次之；但是70%乙醇洗脱产物总黄酮纯度最高，且回收率、解吸率与90%乙醇相近。从节约成本角度考虑，选择70%乙醇液为洗脱剂。

2.2.6 洗脱曲线

按上述确定的吸附和洗脱条件，取追风伞供试品溶液上柱，然后洗脱，分段收集洗脱液。每10 mL收集1份，共收集20份，分别检测洗脱液中追风伞总黄酮浓度，绘制动态洗脱曲线，结果见图2。

图2 D101型大孔吸附树脂对总黄酮的动态洗脱曲线

由图2可见，当洗脱液体积为180～200 mL时，总黄酮浓度相当，即洗脱液体积为180 mL时，总黄酮已接近洗脱完全。洗脱剂用量过多会增加洗脱时间，延长生产周期，同时也造成浪费，故确定洗脱剂用量以6 BV(以树脂柱体积计)为宜。

2.2.7 动态吸附洗脱验证

取适量追风伞供试液在优选的工艺条件下分离纯化追风伞总黄酮。收集所需成分，测定其浓度后干燥，称重，得棕黄色粉末。然后精密称取100 mg精提物粉末(过大孔吸附树脂纯化后的总黄酮粉末)和粗提物粉末(直接浓缩提取液干燥得到)各1份， 分别用60%乙醇使其溶解后定容于100 mL容量瓶中，摇匀，平行取3份测定总黄酮浓度。结果发现，经大孔吸附树脂纯化得到的精提物中追风伞总黄酮的纯度可达86.2%，约为粗提物纯度(20.65%)的4倍，且回收率超过90%。

3 结论

通过静态吸附实验比较了7种不同类型大孔吸附树脂的吸附特性，综合考察吸附能力与解吸性能，筛选出D101型大孔吸附树脂用于追风伞总黄酮的纯化富集。通过动态吸附实验，确定D101型大孔吸附树脂吸附纯化追风伞总黄酮的最佳工艺为：上样液总黄酮浓度为1.839 mg·mL-1，上样流速为2.0 mL·min-1；洗脱剂为70%乙醇，洗脱剂用量为6 BV。D101型大孔吸附树脂吸附追风伞总黄酮的动态饱和吸附量为80.05 mg·g-1，纯化的追风伞总黄酮纯度达到86.2%，约为纯化前的4倍，且回收率超过90%。D101型大孔吸附树脂适于追风伞总黄酮的吸附纯化。

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