三七总皂苷对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响*

康立源，周志焕，张 萌，柴丽娟，高秀梅，王 怡，郭 红，闫 晨

B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关蛋白（Bax）同属于Bcl-2家族，但却具有相反的作用，前者可以抑制细胞凋亡的发生，后者能够促进凋亡的发生。Bcl-2与Bax结合形成异源二聚体，不显示各自活性；当Bcl-2磷酸化，Bax表达增多或是B细胞淋巴瘤-2相关凋亡（Bad）取代Bax与Bcl-2结合后，Bax随即获释而形成诱导死亡的同源二聚体，进入线粒体破坏其膜的通透性，将细胞色素C和凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）释放至胞浆[1-2]。在三磷酸腺苷（ATP）存在的情况下，细胞色素C能与Apaf-1形成复合体，该复合体可以活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9），再激活caspase-3，启动caspase级联反应，通过特异性地裂解其底物而导致细胞凋亡。本研究用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表达的变化，采用福林-酚法（Lowrry）法检测caspase-3蛋白含量的变化，探讨PNS抑制神经元细胞凋亡的分子机制。

1 材料

1.1 实验动物 孕17~18 d Wistar大鼠由天津中医药大学实验动物中心提供。

1.2 试剂 DMEM/F12培养基、B-27（GIBCO，美国）；胰酶 1∶250（Ameresco，美国），胎牛血清（HYCLONE，美国）；多聚赖氨酸、EDTA（SIGMA，美国）；Mouse Anti-MAP2单克隆抗体（CHEMICON，美国）、青霉素、链霉素（市售分析纯）。TRIzol（invitrogenTM，美国），丙三醇、氯仿、无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂厂），DEPC、Folin—酚（鼎国，北京），合成的上、下游引物（上海生工生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器 Allegra-64R Centrifuge低温高速离心机（BECKMAN，美国），DU-530紫外分光光度计（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美国），ECP3000水平电泳仪（北京六一仪器厂），GENE GENIUS凝胶成像系统（Bio Imaging System，SYNGENE，英国），PCR仪ABI誖7300实时荧光定量系统（Applied Biosystems，美国），Biofuge低温离心机（德国），紫外分光光度计（Backman，美国），荧光分光光度计（岛津，日本）。

2 方法

2.1 神经元细胞（CNC）缺氧复氧损伤模型的复制及分组 参照文献[3-5]，利用三气培养箱，在94%氮气（N2）-5%二氧化碳（CO2）-1%氧气（O2）孵箱内缺氧24 h，95%空气-5%CO2孵箱中复氧24 h，复制CNC缺氧复氧（H/R）损伤模型。分组及各组处理方案如下：1）Control：置换无血清培养液继续培养48h，不做缺氧复氧处理。2）H/R组：置换无血清培养液，将培养板放入94%N2-5%CO2-1%O2条件下的三气培养箱缺氧孵育24 h，再于95%空气-5%CO2培养箱复氧孵育24 h。3）H/R+PNS 50 mg/L组：置换含PNS 50 mg/L无血清培养液，将培养板放入94%N2-5%CO2-1%O2条件下的三气培养箱缺氧孵育24 h，再于95%空气-5%CO2培养箱复氧孵育24 h。4）H/R+PNS 10 mg/L组：置换含PNS 10 mg/L无血清培养液，将培养板放入94%N2-5%CO2-1%O2条件下的三气培养箱缺氧孵育24 h，再于95%空气-5%CO2培养箱复氧孵育24 h。5）H/R+PNS 2 mg/L组：置换含PNS 2 mg/L无血清培养液，将培养板放入94%N2-5%CO2-1%O2空气条件下的三气培养箱缺氧孵育24h，再于95%空气-5%CO2培养箱复氧孵育24h。

2.2 实时荧光定量RT-PCR检测缺氧复氧神经元凋亡相关基因mRNA的表达

2.2.1 总RNA的提取与检测 六孔板弃培养液，冷PBS洗2次，每孔加500 μL裂解液TRIzol，反复吹打，转移至1.5 mLEppedorf管中。将样品在室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加0.1 mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置15~30 min。4℃12 000 r/min离心15 min，样品分成3层：红色的有机相，中间层和无色的水相。把水相转移到新的无RNase的离心管中。缓慢加入1倍体积-20℃保存的丙三醇，混匀，置-20℃2 h以上，充分沉淀RNA。4℃10 000×g离心10 min，弃上清。沉淀加入75%乙醇 1 mL，重新悬浮，4℃ 8 000×γ离心10 min，弃上清液。超净台内，室温挥发5 min，加入适量无RNnase水轻轻吹打沉淀，使之溶解，分装备用。紫外分光光度法检测RNA样品的浓度及纯度，1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

2.2.2 引物序列的设计与合成 引物由上海生工生物技术有限公司合成，检测基因的引物序列如下：Bcl-2：Forward primer：TCTGTGGATGACTGAGT ACCTGAAC；Reverse primer：AGAGACAGCCAGGAG AAATCAAAC。Bax：Forward primer：GGGTGGTTGCC CTTTTCTACT；Reverse primer：CCCGGAGGAAGTCC AGTGTC。caspase-3：Forward primer：AATTCAAGGG ACGGGTCATG；Reverse primer：GCTTGTGCGCGTAC AGTTTC。GAPDH：Forward primer：CCCCCAATGTAT CCGTTGTG；Reverse primer：TAGCCCAGGATGCCCT TTAGT。

2.2.3 反转录 反应体系：10×Taqman RT buffer，1 μL；RNase free water，2 μL；25 mmol/L 氯 化 镁（MgCl2）2.2 μL；Dntp mixture，0.5，Rnase inhibitor，0.2 μL；Multistreble Reverse Transprime，0.25；RNase Free H2O，Variable。轻轻混匀，分别按各样本RNA的含量加入RNA，用 RNase free water补足 10 μL。反转录条件：25℃ 10 min；48℃ 30 min；95℃ 5 min。

2.2.4 实时荧光定量RT-PCR实验方法 使用ABI誖7300实时定量PCR仪，采用相对定量实验方法。每个指标每次实验反应6个不同的样本，重复3次。反应体系：2× Master Mix 12.5 μL；Forward primer and Reverse primer 0.5 μL；cDNA sample 0.5 μL；RNase Free H2O 11.5。热循环条件参数如下：50℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，40 cycles。

2.2.5 数据处理 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，与拷贝量呈反对数关系。应用ABI誖7300实时定量PCR仪分析软件调整基线和阈值后，查看并分析反应板数据，获得每个样品每次反应的Ct值，计算得到其△Ct，进行数据统计[6]。△Ct=Ct待测基因－Ct内参照基因△△Ct=基因表达=2-△△Ct。

2.3 缺氧复氧神经元caspase-3活性检测以及蛋白质定量

2.3.1 缺氧复氧神经元caspase-3活性检测 取处理好的接种于6孔培养板的细胞，每孔加入0.125%胰酶 500 μL,消化 3~5 min，加入 100 μL 胎牛血清终止消化，加入1 mL冷PBS，轻轻吹打，并收集细胞到离心管中。4℃，800 r/min，离心5 min，轻轻吸去上清，加入3 mL冷磷酸盐缓冲液（PBS），重新悬浮细胞，重复此步骤一次，转移至1.5 mL Eppendorf管中，4℃，1 000 r/min，离心 5 min，小心吸去上清液。沉淀加入1×细胞裂解液，反复冻溶3次，4℃，500 r/min，离心5 min。取上清，采用Lowrry法测定裂解液中蛋白浓度。取上清液50 μL加入黑色酶标板中，加入50 μL底物工作液，同时作空白对照。室温，避光孵育30 min，荧光分光光度计检测荧光强度。激发波长360nm，发射波长460nm，光敏强度40。

caspase-3标准曲线制作：取7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），制成10 mmol/L的标准品贮备液备用。取标准品贮备液，稀释为 0、1、10、20、30、40、50、100 μmol/L 8个浓度，每个浓度做一个复孔。分别取不同浓度的标准品50 μL加入黑色酶标板中，加入50 μL底物工作液。室温，避光孵育30 min，荧光分光光度计检测荧光强度。

2.3.2 缺氧复氧神经元caspase-3蛋白质定量 采用Lowrry法测定蛋白含量：反应液配制：将1 g碳酸钠（Na2CO3）溶于 50 mL 0.2 mol/L NaOH 中，0.5 g明矾（CuSO4·5 H2O）溶于100 mL 1%酒石酸钠溶液中。然后将前者50 mL与后者1 mL混合，备用。将Folin—酚试剂稀释至1 mol/L，备用。标准曲线制作：配制25 g/L的牛血清白蛋白贮备液，稀释至250，200，150，100，50，25，20，10，0 mg/L；取 11 支试管，编号，分别加入不同浓度的蛋白标准液1 mL，以去离子水做空白对照，加入5 mL反应液，漩涡混匀，室温孵育30 min，再加入1 mLFolin—酚试剂，混匀，室温孵育10 min，然后于500 nm处，1 cm光径比色皿，测定吸光度。样品测定：取20 μL细胞裂解上清液，稀释至1 mL（稀释50倍），加入5 mL反应液，漩涡混匀，室温孵育30 min，再加入1 mL 1 mol/L的Folin—酚试剂，混匀，室温孵育10min，然后于500nm处，1 cm光径比色皿，测定吸光度。

2.3.3 数据处理 1）蛋白含量：制作标准曲线，计算回归方程和R2值，根据标准曲线，计算样品蛋白含量，见图1。

图1 蛋白含量曲线图

蛋白含量=（样品吸光度-0.002 6）×50/0.000 5

2）caspase-3含量：制作标准曲线，计算回归方程和R2值，根据标准曲线，计算caspase-3含量。

3）caspase-3-like-activity=[（样品吸光度-78.426）/28.594]/蛋白含量

3 结果

结果表明，H/R组Bax表达显著升高，与control组比较有显著差异（P<0.05），PNS可以显著降低Bax表达，50、10 mg/L与H/R组比较有显著性差异（P<0.05）；H/R组Bcl-2表达明显降低，与control组比较有显著差异（P<0.05），PNS可以增加Bcl-2表达，50 mg/L与H/R组比较有显著性差异（P<0.05）；H/R组caspase-3表达有升高的趋势，PNS有降低caspase-3表达的趋势，但无显著差异。H/R组caspase-3活性明显升高，与control比较有显著性差异（P<0.05），PNS 50、10、2 mg/L各剂量组均能够抑制caspase-3的活性，有剂量依赖性趋势。见表1，见表2。

表1 PNS对缺氧复氧致CNC损伤细胞凋亡相关基因表达的影响（s）

表1 PNS对缺氧复氧致CNC损伤细胞凋亡相关基因表达的影响（s）

注：与对照组比较，#P<0.05,与H/R比较，*P<0.05。

组别对照组H/R H/R+PNS 50 mg/L H/R+PNS 10 mg/L H/R+PNS 2 mg/L caspase-3 0.66±0.08 0.83±0.11 0.73±0.25 0.79±0.24 0.82±0.31 n66666 Bcl-2 1.29±0.29 0.77±0.10#1.21±0.44*1.08±0.26 0.94±0.35 Bax 0.72±0.04 1.06±0.26##0.75±0.21*0.76±0.14*0.92±0.23

表2 PNS对缺氧复氧致CNC损伤神经元caspase-3活性的影响

4 讨论

Bcl-2、Bax同属于B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族，但却具有相反的作用，前者可以抑制细胞凋亡的发生，后者能够促进凋亡的发生。Bcl-2与Bax结合形成异源二聚体使其失活，当Bcl-2磷酸化，Bax表达增多或是Bad取代Bax与Bcl-2结合后，Bax随即获释而形成诱导死亡的同源二聚体，进入线粒体破坏其膜的通透性，将细胞色素C和Apaf-1释放至胞浆[1-2]。在ATP存在的情况下，细胞色素C能与Apaf-1形成复合体，该复合体可以活化caspase-9，再激活caspase-3，启动caspase级联反应，通过特异性地裂解其底物而导致细胞凋亡。当细胞内Bcl-2较多时，Bcl-2和Bax的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱；当细胞内Bax较多时，Bax本身形成的同源二聚体占主导，则易于发生凋亡。所以Bcl-2/Bax比值对于决定细胞是否进入凋亡状态具有重要意义。PNS可以抑制促凋亡基因Bax的表达，增加抑制凋亡基因Bcl-2。一方面，Bcl-2可以Bcl-2和Bax的形成异源二聚体，直接发挥抗凋亡作用，另一方面，可以调节线粒体MPTP的开闭。线粒体是Bcl-2蛋白和Bax蛋白在细胞内的主要分布部位，Bcl-2蛋白对线粒体主要功能之一是通过调节线粒体膜上的MPTP[7]，线粒体MPTP孔位于富含Bax、Bcl-2的地方。由于Bax和Bcl-2有不同的离子选择性，Bax促进MPTP孔开放，释放CytC，激活caspase级联反应，诱导细胞凋亡；Bcl-2、抑制MPTP孔开放，阻止细胞凋亡。

研究结果显示，在适宜的浓度范围内，PNS使Bcl-2基因的表达上调，Bax基因的表达下调，PNS有抑制caspase-3mRNA的表达，抑制caspase-3活性的趋势，进而调节线粒体膜上的凋亡相关蛋白，一方面，减少线粒体膜电位丧失，抑制MPTP的开放，另一方面直接抑制凋亡的发生；PNS可能是通过上述途径，调节了线粒体信号转导通路上，凋亡相关的几个环节，而发挥抗凋亡作用的。

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[3]商洪才.丹酚酸A神经保护效应评价及机制[D].天津中医药大学博士学位论文集.天津:天津中医药大学,2005:165.

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