银杏叶提取物EGB761对高胆固醇血症家兔血脑屏障通透性的影响*

王 强，姜希娟，范英昌，张瑞峰，郭茂娟，马东明，卢 斌

近年来，高胆固醇血症的发病率呈现上升态势，随着血中胆固醇浓度的升高，血脑屏障的完整性可能会遭到破坏[1]。而银杏叶提取物作为一种可调节胆固醇的中药有效成分，是否可以维持血脑屏障的完整性，目前研究甚少。因此，本研究参照Sparks等的方法复制高胆固醇血症家兔模型，观察银杏叶提取物德国常用类型EGB761，对高胆固醇血症家兔的血脑屏障（BBB）完整性是否产生影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 银杏叶提取物EGB761（商品名：金纳多），德国威玛舒培博士药厂，批号:9840808。辛伐他汀（商品名：赛夫丁），南通华山药业有限公司，批号：081202。其余试剂均为市售分析纯。

1.2 动物模型的建立 39只健康成年雄性新西兰大白兔（军事医学科学院实验动物中心），体质量为（2 356±212）g，先给予普通饲料和自来水适应喂养2周，温度（28±2）℃，湿度为 37%～48%。2周后，随机取出9只作为对照组，饲以普通饲料，直到实验结束，共9周。其余30只家兔参照D.Larry Sparks等的方法，采用2%高胆固醇饲料喂养6周，以复制高胆固醇血症家兔的造模[2]。此时对照组血清总胆固醇一般低于60 g/L，其他各组血清总胆固醇若高于1 400 g/L，提示高胆固醇血症模型复制成功，为达到1 400 g/L者则要淘汰出实验。结果30只家兔造模成功28只，淘汰2只，另因高胆固醇血症导致脑部疾患死亡2只。

1.3 实验分组及处理方法 将26只造模成功的家兔随机分为模型组（n＝8），继续给予高胆固醇饲养3周。（由于停用胆固醇饲料后，家兔胆固醇水平会很快降低，故须继续给予高胆固醇）。阳性药辛伐他汀组（n=8），辛伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃3周，其余处理同模型组。EGB761组（n＝10），EGB76150mg/（kg·d）灌胃3周，其余处理同模型组（上述药物剂量为“按照成人体表面积折算的等效剂量”）。药物干预结束后，次日空腹、称质量。将所有家兔从耳缘静脉注射25 mg/kg伊文思兰（EB），3 h后麻醉，采用生理盐水心脏灌流，至右心耳流出无色清亮液体为止，断头取海马、嗅球和皮质。

1.4 伊文斯蓝（EB）测定 制作标准曲线：称取4 mg EB，加生理盐水至总容积25 mL，然后取0.3 mL置于试管中，加入5.7 mL的甲酰胺，浓度为8 mg/L，作为第1管。再从第1管中取出3 mL液体，并加入3 mL甲酰胺作为第2管。以此类推共稀释7管，其浓度依次为 8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg/L，以此梯度浓度制作标准曲线。按照2 mL/g脑组织湿质量加入甲酰胺。室温避光孵育72 h，然后10 000 g离心10 min，收集上清。用荧光分光光度计在620 nm的条件下进行比色，依据其OD值计算出EB的浓度，以每克脑组织湿质量内所含EB的量（μg）表示。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0软件包进行分析,数据以均数±标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

模型组血脑屏障EB含量显著升高，与对照组相比有统计学差异，见表1。

3 讨论

实验以EB透过量作为BBB破坏的示踪剂，观察BBB的通透性，是因为EB的分子量与血浆白蛋白相近,且进入血浆后可与白蛋白结合，而血浆白蛋白在BBB损伤的状况下可最优先透过BBB[3-7]。采用伊文思兰透过实验，发现高胆固醇饮食家兔脑组织EB含量增加，间接反映了高胆固醇可以提高BBB的通透性。研究结果与以往研究相一致：高胆固醇饮食家兔BBB的通透性明显升高[8]。其机制可能是：高胆固醇饮食诱导血胆固醇浓度升高，继而导致BBB上紧密连接蛋白如闭锁小带蛋白（ZO-1）、occludin等失调，从而引发BBB完整性的缺失有关[8]（该资料将在另外文章中阐述）。

表1 银杏叶提取物EGB761对嗅球、海马、皮质EB含量的影响（s）μg/g

表1 银杏叶提取物EGB761对嗅球、海马、皮质EB含量的影响（s）μg/g

注：与模型组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

组别对照组模型组辛伐他汀组EGB761组皮层EB 0.25±0.03▲0.39±0.03 0.39±0.02 0.39±0.02 n988 10嗅球EB 0.25±0.01▲▲0.45±0.03 0.38±0.01▲▲0.38±0.01▲▲海马EB 0.15±0.03▲▲0.41±0.03 0.36±0.04▲0.36±0.05▲

银杏叶提取物是从银杏科植物银杏叶中分离纯化的提取物，主要成分为黄酮糖苷类和萜烯内酯类物质。EGB761作为一种公认的银杏叶提取物标准制剂，其对各种脑损伤的保护作用已引起国内外的广泛关注。但是，EGB761是否可以调节高胆固醇引发的BBB通透性尚未见报道。实验结果显示银杏叶提取物EGB761可以有效降低嗅球和海马部位BBB的通透性。与阳性药物辛伐他汀相比其疗效没有显著性差异，说明银杏叶提取物EGB761可有效保护BBB完整性，然而对皮质量BBB的完整性保护作用并不明显。其作用机制可能与抑制claudin的磷酸化，而磷酸化的claudin可干扰紧密连接的形成[9]，从而有可能纠正BBB上occludin等的失调有关，然而其详细机制尚待进一步阐明。

[1]Robert.Raffai,Karl H.Weisgraber.Cholesterol:from heart attacks to Alzheimer,s disease[J].Journal of Lipid Research.2003,44:1423-1430.

[2]D.Larry Sparks.Coronary Artery Disease,Hypertension,ApoE,and Cholesterol:A Link to Alzheimer’s Disease[J].Ann N Y Acad Sci,1997,826(13):128-46.

[3]于 艳,周 亮,徐 风,等.血脑屏障与阿尔茨海默病的发病及防治[J].神经疾病与精神卫生,2008,8(6):411-413.

[4]张 峰,高 爽,马 燕,等.血脑屏障上claudin的研究进展[J].日本医学介绍,2007,28(1):37-39.

[5]Luigi Puglielli,Rudolph E,Tanzi,et al.Alzheiner,s disease:the cholesterol connection[J].Nature neuroscience,2003,6(4):345-351.

[6]Joseph H.Rapp,Xian Mang Pan,Melanie Neumann,et al.Microemboli Composed of Cholesterol Crystals Disrupt the Blood-Brain Barrier and Reduce Cognition[J].Journal of the American Heart Association,2008,39:2354-2361.

[7]石向群,杨金升,石 莉.伊文思蓝、ZO-1评估血脑屏障损伤的应用研究[J].西北国防医学杂志,2004,25(5):329-332.

[8]Xuesong Chen,Jeremy W Gawryluk,John F Wagener,et al.Caffeine blocks disruption of blood brain barrier in a rabbit model of Alzheimer’s disease[J].Journal of Neuroinflammation，2008，5（12）：1-14.

[9]巩沅鑫,周其全.银杏叶提取物对血脑屏障通透性保护作用的分子机制[J].中国新药杂志,2008,17(7):1474-1477.