HPLC法测定苏木-7汤中羟基红花黄色素A的含量

席金花

苏木-7汤由苏木、红花、土木香、甘草、山萘、石膏、血竭七味药组成的复方制剂具有活血、破血、祛滞的功效;用于妇女闭经，干血痨等病症。本方选择红花，进行含量测定方法的研究，以有效控制制剂的质量。红花具有活血通经、散瘀止痛功效。主含红花苷类，红花多糖和有机酸。其中查尔酮类成分羟基红花黄色素A、黄色素A以及多种黄酮醇化合物如:槲皮素及其苷类，山萘酚及其苷类等是红花中的主要活性成分;参照《中国药典》2005年版一部“红花”项下的含量测定方法，选择羟基红花黄色素A作为指标成分，对本方中的红花进行了HPLC含量测定方法研究。经分析方法验证，表明该方法重现性好，专属性强，方中其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰，适合于苏木-7汤的质量控制［1］。

1 仪器试剂试药与样品

1.1 仪器 SHIMADZVLC-10Avp，LC-10ATvp型泵，SCL-10Avp型控制器，SPD-10AVP型检测器，CLASS－VP色谱工作站，岛津UA-1700型紫外 －可见分光光度计。Sartovius BP121S(d=0.1 mg)，BP211D(d=0.01 mg)电子分析天平。HU3120B超声波清洗器(120W，40KHZ;天津市东科仪器设备有限公司)。

1.2 试剂试药 羟基红花黄色素A对照品(批号:111637-200503中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)。甲醇、乙睛为色谱纯，磷酸为分析纯，水为高纯水。

1.3 样品 苏木-7汤样品，红花原料药材由内蒙古中蒙医院提供。

2 方法验证

2.1 色谱条件的选择 色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，本试验研究采用Diamousil(钻石)C18柱(250 mm×4.6 mm;5 μm)，流动相为 A:甲醇-乙睛(19:2)B:0.7%磷酸溶液以三乙胺调节PH值 至(6.0±0.1);A:B(20:80)，检测波长为403nm，柱温35℃。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算，应不低于 3000［2］。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25%甲醇制成每1 ml含33 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备的制备 取本品约1.0 g，精密称定，精密加入25%甲醇25 ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率40KHZ)40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。另取按处方量并以相同工艺制备的阴性对照(缺红花)适量，依上法操作即得阴性对照液。

2.4 阴性对照试验 在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，测得结果为:阴性对照色谱中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱中相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。见色谱图(A、B、C)。

2.5 线性关系考察 取羟基红花黄色素A对照品约3.0 mg精密称定，置50 ml量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀(相当于含羟基红花黄色素A0.0652 mg/ml)精密吸取 1、3、5、7、9、10 ml溶液分别置 10 ml量瓶中，加 25% 甲醇至刻度，摇匀，各取20μl进样，按上述色谱条件测定，以峰面积对进样量进行回归分析，结果羟基红花黄色素A在0.1304～1.304 μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h进样测定，结果羟基红花黄色素A峰面积积分值基本稳定，RSD为0.81%，结果表明在12 h内供试品溶液基本稳定。

2.7 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，连续进样5次，测定羟基红花黄色素A峰面积积分值，RSD为0.9%。

2.8 重复性试验 取同一批号(批号020930 1号样)供试品6份，各约1.0 g，精密称定，分别按含量测定项下方法操作，测得每份供试品含量，结果平均含量为0.9820 mg/g，RSD为0.85%，表明结果较好。

2.9 加样回收试验 取供试品(批号020930 1号样，含量0.9820 mg/g)9份，各约0.50 g，精密称定，分别在其中3份中各精密加入浓度为0.0501 mg/ml的羟基红花黄色素A对照品25%甲醇溶液5 ml，再分别精密加入25%甲醇溶液20 ml;另3份中各精密加入浓度为0.0501 mg/ml的羟基红花黄色素A对照品25%甲醇溶液10 ml，再分别精密加入25%甲醇溶液15 ml;其余三份各精密加入浓度为0.0501 mg/ml的羟基红花黄色素A对照品25%甲醇溶液15 ml，再分别精密加入25%甲醇溶液10 ml，分别按含量测定项下方法操作，进样20 μl，测定每份含量，计算回收率，结果见表1。

2.10 供试品含量测定 分别精密吸取2.2对照品溶液和2.3供试品溶液各20 ul，在2.1色谱条件下进行测定。供试品含量测定结果见表2。

表1 羟基红花黄色素A加样回收试验结果

表2 供试品中羟基红花黄色素A含量测定结果

3 讨论

检测波长的选择:取羟基红花黄色素A对照品溶液，于岛津UA-1700型紫外可见分光光度仪上，自200～600 nm做光谱扫描，结果羟基红花黄色素A在404.0 nm处有最大吸收。结合《中国药典》2005年版一部“红花”项下HPLC的检测波长为403 nm，确定检测波长为403 nm。

提取效率的考察:甲醇提取过程中为保证被测成分提取完全，试验中考察了不同超声处理时间对提取效率的影响如:超声处理 30 min、40 min、50 min、60 min。结果超声处理40 min供试品中羟基红花黄色素A含量不再增加，故确定甲醇超声处理40 min。

［1］国家药典委员会，中华人民共和国药典(一部).化学工业出版社，2005:1.

［2］王宝琴.中药质量标准与标准物质研究.中国医药科技出版社，1994，3:484.