富硒绿茶对小鼠部分免疫功能的影响

叶洪平 陈超

茶叶在我国有数千年的历史。绿茶能够预防与生活方式有关的疾病，有延年益寿的作用[1]。茶叶中的主要成分茶多酚更是被作为一种保健品进行研究[2]。硒具有防癌抗癌、预防心血管疾病、延缓衰老等作用[3]。富硒绿茶集绿茶与硒的功效于一身，对人体有很好的保健防病作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 152只清洁级昆明系小鼠，雄性，体重18～22g，购自湖北省实验动物研究中心，饲养于三峡大学动物实验中心。

1.1.2 富硒绿茶叶 由长阳县高山生态园基地出品并提供,测硒含量为0.67mg/kg。

1.1.3 仪器与试剂 旋转蒸发器，RE-5205型，上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，双人单面100级清洁级，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；离心机，LDZ5-2，北京医用离心机厂；培育箱，SHELL/JB TC2323，美国壳牌公司；酶标仪，TECAN in finitetm F200，瑞士TECAN集团；ConA液，Sigm a CO.USA，5ug/m l；MTT液，Sigm a CO.USA。

1.2 方法

1.2.1 茶叶汁的提取 富硒绿茶50g于烧瓶中，分次加蒸馏水500m l、400m l、400m l，电热套加热，保持沸腾状态30m in，冷却无蒸汽后倒出，共煮3次。真空泵抽滤后置旋转蒸发器中，75℃蒸发至500m l,茶叶浓度为10%(W/V)。置4℃冰箱中备用，储存不过3d。

1.2.2 灌胃剂量 LD50的测定(寇氏法)为9.07g/kg。灌胃浓度低、中、高剂量组分别为每公斤体重1.0g、1.5g、2.0g。

1.2.3 腹腔巨噬细胞吞噬能力的测定[4]32只小鼠随机分为低、中、高剂量组、对照组，每组8只。灌胃8d后24h内采用椎骨脱臼法处死。超净工作台上，75%酒精消毒皮肤。无菌注射器取含肝素的冷PBS液(肝素的浓度10m g/m l)8m l灌洗腹腔1m in。抽吸出腹腔灌洗液5m l，制成腹腔巨噬细胞悬液。离心10m in(1500r/m in)。用RPM I1640培养基调整细胞浓度至4×106/m l。加至96孔板中，每样本加2孔，100μl/孔。置37℃、5%CO2培养箱孵育4h。弃去上清液，一孔加0.075%中性红溶液100μl/孔，另一孔作为对照。继续孵育30m in。弃去上清液。加入腹腔巨噬细胞溶解液100μl/孔，置4℃冰箱过夜。置酶标仪530nm处，以对照孔调零，测定各孔吸收度(A值)。

1.2.4 溶血空斑试验[5]40只小鼠随机分为低、中、高剂量组、对照组，每组10只。制备鸡红细胞悬液[6]和补体[5]。灌胃6d。第6天每只腹腔注射0.2m l2%(v/v)鸡红细胞悬液。继续灌胃4d后颈椎脱臼法处死，无菌取脾。用Hanks液制成细胞悬液。200目筛网过滤，洗涤，离心2次(每次10m in，1000r/m in)，将细胞悬浮在5m l Hank液中。将表层培养基加热溶解后与等量的pH 7.4，2倍浓度的Hank液混合，分装小试管，每管0.5m l。加入用阿氏液配制的10%鸡红细胞悬液5μl(v/v)。加入20μl脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，凝固，置于CO2培养箱中温育1.5h，加入阿氏液稀释的补体(1：10)，继续培育1.5h。计数溶血空斑数。

1.2.5 ConA诱导脾淋巴细胞转化试验[5]40只小鼠随机分为低、中、高剂量组、对照组，每组10只。灌胃30d后24h采用椎骨脱臼法处死。无菌取脾，置于Hank液中，轻轻磨碎，200目筛网过滤。离心10m in(1000r/m in)。将细胞悬浮液1m l置于RPM I1640完全培养基中。0.4%台盼蓝染色，计数活细胞数(应在95%以上)。调整细胞浓度为3×106/m l。将细胞悬液分2孔加入12孔培养板中，每孔1m l。一孔加75μlConA液，另一孔加入培养液75μl作为对照。置37℃、5%CO2培养箱孵育72h。培养结束前4h每孔轻轻吸去上清0.7m l后加入0.7m l不含小牛血清的RPM I1640培养液。同时加入M TT液(5m g/m l)50μl/孔，继续培养4h。出培养箱后每孔加入1m l酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入96孔培养板中，置酶标仪570nm处，以对照孔调零，测定吸收度(A值)。

1.2.6 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验[5]40只小鼠随机分为低、中、高剂量组、对照组，每组10只。每只腹腔注射1m l20%的鸡红细胞悬液后30m in颈椎脱臼法处死。仰卧固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2m l，转动鼠板1m in，吸出腹腔洗液1m l。平均分滴于2片载玻片上，放入垫有纱布的搪瓷盒内，置于37℃培养箱孵育30m in。放入生理盐水中漂洗、晾干，以体积1：1的丙酮-甲醇溶液固定。用4%Giem sa-磷酸缓冲液染色3m in，蒸馏水漂洗晾干。每张片油镜下观察100个巨噬细胞，计数已经吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬百分率。

2 结果

各试验结果见表1。

表1 各试验结果(±s)

表1 各试验结果(±s)

注：与对照组比较，a P 0.05，b P 0.01；与低剂量组比较，c P 0.01，d P 0.05。

组别 吞噬能力(A值) 溶血空斑数(个/1×105脾细胞) 转化试验吸收度(A值) 吞噬百分率(%) 吞噬指数(%)对照组 0.159±0.016 35.4±2.68 0.00244±0.00053 29.5±4.70 0.41±0.08低剂量组 0.194±0.019b 38.4±2.36a 0.00285±0.00028a 33.5±2.90▲ 0.49±0.08▲中剂量组 0.220±0.027bd 41.5±1.50bc 0.00295±0.00030b 34.4±2.60b 0.51±0.07b高剂量组 0.230±0.029bd 42.1±2.32bc 0.00253±0.00046 31.3±4.50 0.44±0.07

结果表明，腹腔巨噬细胞吞噬活力测定显示低、中、高剂量组与对照组相较吞噬能力均有显著提高(P均 0.01)；中、高剂量组与低剂量组相较吞噬能力也有所增强(P 0.05)；中、高剂量组之间差异无统计学意义(P 0.05)。溶血空斑试验显示低、中、高剂量组与对照组相比较，抗体生成能力均有显著提高(前者P 0.05，后两者P 0.01)；中、高剂量组与低剂量组相较抗体生成能力有显著提高(P 0.01)；中、高剂量组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。ConA诱导脾淋巴细胞转化试验显示低剂量组与对照组相较，P 0.05，差异有统计学意义；中剂量组与对照组相较，P＜0.01，差异有统计学意义；高剂量组与对照组相较，P 0.05，差异无统计学意义，说明低、中剂量组能够促进脾淋巴细胞的转化，高剂量组不能促进脾淋巴细胞转化。腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验显示吞噬百分率和吞噬指数低、中剂量组和对照组相较，P值分别为P 0.05、P 0.01，差异均有统计学意义；高剂量组与对照组相较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明低、中剂量组能够增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力，高剂量组不能增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

3 讨论

茶叶中含有茶多酚、茶多糖、咖啡碱、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等营养和药理成分，对机体产生综合的生理调节作用[7]。

硒的作用越来越被重视，但我国成人硒日摄取量仅为26～32μg[8]。通过补充膳食中的硒能显著降低缺硒人群消化道肿瘤的发生[9]。富硒绿茶无疑是一条通过食物链补硒的安全、经济、方便、有效的新途径。富硒绿茶由于具有绿茶和微量元素硒两者共同的保健作用，很受人们的喜爱。

硒是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的重要组成部分，在机体内起抗氧化作用。硒能够增强机体的特异性和非特异性免疫功能，其主要机制[10]为：通过谷胱甘肽过氧化物酶及其同工酶和其他硒化合物清除自由基；清除活性氧，减少脂质过氧化物(LPO)的产生，从而保护细胞膜免受过氧化物损害；调节细胞表面或附近的含-SH的化合物，调节免疫细胞的增殖与分化，影响免疫应答水平；激活淋巴细胞酶系中的一些酶而加强淋巴细胞功能。

绿茶最重要也是最关键的药理作用是天然抗氧化性及清除自由基的作用，起主要作用的是茶多酚[11]。茶多酚抗氧化的机制有人概括为[12]：抑制氧化酶系和对抗氧化酶系的激活作用；直接灭活自由基；络合诱导氧化的过渡金属离子；保护或再生维生素C、维生素E和GSH；协同其他抗氧化剂的作用；增强机体免疫功能。因此，绿茶也具有免疫调节功能，与微量元素硒发挥协同作用。

本组试验低、中剂量组短期(10d左右)、长期(30d)4项试验结果都证实富硒绿茶有增强免疫功能的作用。高剂量组短期试验有增强免疫的功效，其增强作用并不比中剂量组强(P＞0.05),但长期试验并不能增强免疫功能。长期试验中体重的观察显示，低、中、高剂量组都能够显著抑制体重增长，以高剂量组最为突出。说明富硒绿茶增强免疫功能的作用并不与剂量呈正相关，可能与机体免疫功能被调节的幅度受限有关，也可能与高剂量组体重增长过于缓慢抵消了免疫增强作用有关，提示长期高剂量饮用富硒绿茶可能对机体存在潜在的损害。

[1]Sueoka N,Suganuma M,Sueoka E,et al.A new function of green tea:prevention of lifestyle-related diseases[J].Ann N Y Acad Sci,2001,928:274-280.

[2]王岳飞.茶儿茶素制剂毒理学安全性评价与保健功效研究[D].浙江大学博士学位论文,2004:29-34.

[3]Rayman MP.The importance of selenium to human health[J].Lancet,2000,356(9225):233-241.

[4]王晓京,丁桂凤,范少光.几种阿片肽及ACTH对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响[J].中国免疫学杂志,1987,3(3):211-212.

[5]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002:1433-1457.

[6]药理学实验编写组.药理学实验[M].北京:人民卫生出版社,1995:107.

[7]余芳.富硒绿茶功能成分的抗氧化和抗肿瘤作用及其机理研究[D].