六种中药提取物对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用的比较

董淑珍,付志新,宋 瑜,马艳华,曹旺斌

(1.河北科技师范学院,河北昌黎 066600;2.中国环境管理干部学院,河北秦皇岛 066004;3.河北科技师范学院欧美学院,河北秦皇岛 066600)

六种中药提取物对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用的比较

董淑珍1,付志新1,宋 瑜2,马艳华3,曹旺斌1

(1.河北科技师范学院,河北昌黎 066600;2.中国环境管理干部学院,河北秦皇岛 066004;3.河北科技师范学院欧美学院,河北秦皇岛 066600)

采集昌黎地区29头外观健康正常的奶牛乳样116份,经CMT(加利福尼亚乳房炎试验)诊断出阳性病例并从阳性乳样中分离鉴定出其中的优势菌;再用连翘、当归、金银花、王不留行、蒲公英、川芎等中药提取物对该菌进行体外抑菌试验。结果表明,引起该地区奶牛隐性乳房炎的主要细菌为金黄色葡萄球菌,经诊断患有该病的奶牛为15例,患病阳性率为51.7%,116个乳样中有30个为阳性,对应乳区阳性率为25.9%;试验中所选中药对金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中以750 mL/L醇提的连翘效果最为明显。

隐性乳房炎;金黄色葡萄球菌;中药提取物;体外抑菌;奶牛

奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最常见的疾病之一。全世界约有2.2亿头奶牛,其中约1/3患各种类型的乳房炎[1]。据统计,约有97%的乳房炎属于隐性乳房炎[2]。奶牛乳房炎仍然是奶牛群中花费最多的疾病之一,且是造成早期犊牛大批发生胃肠道疾病与死亡的原因之一[3]。奶牛乳房炎是其乳腺受到微生物感染,其中最主要的是病原微生物感染[4]。其中金黄色葡萄球菌是乳房炎的重要致病菌之一,它引起的乳房炎多为亚临床感染,但其急性或复发性暴发比链球菌多见,病变区会纤维化和形成微小脓肿,造成永久性实质破坏。最急性金黄色葡萄球菌乳房炎易导致坏疽。坏疽时,毒血症症状加重,病区有水疱,浆液渗出,触之发凉,呈黑色。乳房炎的传统治疗措施为应用抗生素治疗,由于长期使用抗菌药物治疗,使耐药菌株不断产生,疗效降低,随着用药量逐渐增大,造成乳中药物残留超标,影响人类健康,从而严重阻碍了奶业生产的发展。中药属于纯天然制品,毒性低,不会造成严重的药物残留,不易产生抗药性,克服了使用抗生素的某些不足[5],因此,使用中药治疗乳房炎的研究一直倍受关注。本试验通过对河北省昌黎地区某奶牛场29头隐性乳房炎奶牛致病菌进行分离鉴定,并运用中药提取物进行体外抗菌试验,旨在为治疗奶牛隐性乳房炎筛选合适的中药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 连翘、当归、金银花、王不留行、蒲公英、川芎6味中药材,购自昌黎县乐民药店。

1.1.2 乳样 河北省昌黎地区某奶牛场中外观表现正常的29头奶牛的116份奶样 。

1.1.3 主要仪器 医用净化工作台,立式压力蒸汽灭菌器筒,电热恒温培养箱,微波炉,CMT(加利福尼亚乳房炎试验)诊断盘,旋转蒸发器等。

1.1.4 主要试剂 普通营养琼脂、伊红美蓝琼脂、三糖铁琼脂、营养肉汤琼脂等(杭州天和微生物试剂有限公司制造,批号:20080320);CMT诊断液(北京三元集团畜牧兽医总站,批号:20080110);甘露醇微量发酵(广东环凯微生物科技有限公司生产,批号:20087110);革兰染色液(杭州天和微生物试剂有限公司制造,批号:20080320);过氧化氢(批号:20090120);成年公绵羊脱纤维血等。

1.2 方法

1.2.1 乳样的采集及隐性乳房炎的诊断 用温水清洗乳房,用毛巾擦干净,弃去前两把奶,取乳汁约5 mL,装入青霉素小瓶内,置4℃冰箱保存备用。诊断时用干净的诊断盘进行,每个乳盘中将被检牛4个乳区的乳依次放入2 mL,再加入等量的CMT诊断试液,呈同心圆摇动诊断盘,根据混合物的凝集反应和颜色变化综合判定结果。

1.2.2 诊断标准 根据国际乳业联合会(IDF),奶牛隐性乳房炎诊断标准进行诊断。

1.2.3 病原的分离与鉴定 对诊断出患有隐性乳房炎奶牛的乳区进行无菌采集乳样,先温水清洗乳房,用毛巾擦干净,碘酊消毒,5 min后,750 mL/L酒精脱碘,用一次性纸巾吸干酒精,戴一次性灭菌手套采集乳样,将其放入灭菌的青霉素小瓶中,置于4℃保存备用。将无菌采集的乳样分别划线接种于血液琼脂平板和普通营养琼脂平板中,在37℃下培养24 h。再挑取单个优势菌落接种到普通营养琼脂、血液平板和伊红美蓝营养琼脂上培养24 h。观察菌落形态,再分别涂片并革兰染色。根据菌落形态,菌体及其染色特征初步确定细菌的类属,然后再按常规方法进行生化鉴定。

1.2.4 中药的提取及药液制备

1.2.4.1 水煮法 准确称取中药材20 g置于圆底烧瓶中,加10倍量蒸馏水,浸泡30 min后加冷凝管回流提取1 h(回流时调温电热套电压220 V,沸腾后电压调至50 V;沸腾后开始计时),过滤并收集滤液,药渣再加入10倍量蒸馏水回流提取1 h(方法同上),过滤,合并上次的滤液,在水浴锅上挥发至干燥,获得提取物。

1.2.4.2 750 mL/L乙醇提取法 准确称取中药材20 g置于圆底烧瓶中,加10倍量750 mL/L乙醇,浸泡30 min后加冷凝管回流提取1 h(回流时调温电热套电压220 V,沸腾后电压调至50 V;沸腾后开始计时),过滤并收集滤液,旋转蒸发至膏状,干燥,获得提取物。

1.2.4.3 药液的制备 准确称量中药提取物1 g,加入1 mL的蒸馏水,配制成1 g/mL的母液。再将母液稀释10倍置于1.5 mL Eppendorf管中备用。

1.2.5 药物敏感性试验 取37℃培养18 h的试验菌肉汤培养液,用灭菌的棉拭子蘸取菌液,均匀的涂在普通营养琼脂平板上,再用打孔器在普通营养琼脂上打孔(直径6 mm),然后在酒精灯火焰上稍微烘烤后,每孔分别加入不同的药液(注意不要溢出孔外),每种药液分别做4次平行试验 ,37℃培养24 h。分别观察并记录不同中药对细菌抑菌圈直径的大小。当抑菌圈直径＜7 mm或无抑菌圈时,因几乎无作用,不记在内。抑菌效果判定标准按《中药药理学》标准:抑菌直径＞20 mm为极敏,15 mm～19 mm为高敏,10 mm～14 mm为中敏,10 mm以下为低敏。

2 结果

2.1 病原鉴定

2.1.1 形态学观察 在普通营养琼脂中菌落成乳白色或黄色,针尖大小,边缘光滑;在血液平板中菌落为大而光滑、边缘整齐、湿润、中等程度隆起,金黄色、浅黄色或灰白色圆形菌落,有的菌落呈β型溶血;在伊红美兰营养琼脂中基本无菌落生长。在显微镜下观察细菌革兰染色为阳性,菌体呈葡萄串状簇集成堆,少数散在成双、短链状排列的紫红色球菌。

在30个阳性乳区中有24个乳区细菌培养呈以上特点,占总数的80%。

2.1.2 生化试验 从表1可以看出,阳性乳区样本中大部分优势菌符合金黄色葡萄球菌的生化特性,故引起该地区奶牛隐性乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌。

表1 主要致病菌鉴定指标Table 1 Identification indexes of the major pathogenic bacteria

2.1.3 药物敏感性试验的结果 由表2可知,连翘、当归、金银花、王不留行、蒲公英和川芎的不同方法提取物都对金黄色葡萄球菌有抑菌作用。其中750 mL/L醇提的连翘、水提的连翘和水提的金银花对金黄色葡萄球菌为高敏的抑菌作用;水提的当归、750 mL/L醇提的金银花、水提的王不留行、750 mL/L醇提的王不留行、水提的蒲公英和水提的川芎对金黄色葡萄球菌为中敏的抑菌作用;750 mL/L醇提的当归、750 mL/L醇提的蒲公英和750 mL/L醇提的川芎对金黄色葡萄球菌为低敏的抑菌作用。

表2 中药提取物对金黄色葡萄球菌抑菌试验的效果Table 2 The effect of bacteriostasis test on traditional Chinese drug extract forStaphy lococcus aureus mm

3 讨论

3.1 奶牛隐性乳房炎的发病情况

乳房炎在奶牛业中是一种多发病,临床型乳房炎占乳房炎发病率的很小一部分,约1%～2%,而绝大部分是乳汁和乳房无明显的可见肉眼变化,可从乳汁中能检出很多体细胞和病原菌为特征的,在牛群中更为普遍的隐性乳房炎[6]。萧乾庆等[7]、杨素平[8]李国江[9]报道我国奶牛隐性乳房炎头阳性率分别为51.3%,54.1%和46.4%;单志贵[10],萧乾庆等,杨章平等报道隐性乳房炎乳区阳性率分别为59.1%、31.9%和28.0%。本试验中测定的昌黎地区的奶牛隐性乳房炎头阳性率为51.7%,乳区阳性率为25.9%,与国内报道基本一致。临床型乳房炎给生产造成的损失显而易见,而隐性乳房炎所造成的潜在生产性能的降低,诸如产奶量下降,牛奶品质较差,奶牛利用年限缩短等经济损失则无法估计。但由于此类患牛乳房和乳汁无明显的可见肉眼变化,所以很难被发现,以致往往被人们所忽视。

3.2 奶牛隐性乳房炎的主要致病菌

奶牛乳房炎是其乳腺受到微生物感染或因物理、化学刺激而引起的一种炎症,多发生于产后哺乳期,其中最主要的因素是病原微生物感染。迄今为止,人们已从奶牛乳房中分离到了130多种微生物,其中包括多种细菌、真菌、病毒、支原体等[11]。病原微生物主要为条件性致病菌,尤其以葡萄球菌、链球菌为主,大肠埃希菌也较常见,这3种细菌引起的乳房炎占总发病率的90%以上[1]。而本试验所鉴定的主要病原菌也属此范畴,即金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌是传染性致病菌,其传播主要发生在挤奶过程中,如通过擦洗乳房用的毛巾、水、挤奶员的手、挤奶杯等传播。

3.3 中药对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

试验所需菌株是直接从患有隐性乳房炎的奶牛乳中分离并鉴定出的主要病原菌——金黄色葡萄球菌,用不同的中药提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性进行测定,其结果更具有说服力。该结果表明试验所选6味中药均对葡萄球菌有一定的抑菌作用,其中以水提的连翘效果最佳,其抑菌圈直径达17 mm,该结果与连学昭[12]的研究结果相似。从试验结果可以得出,中药对所分离的金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用,为中药治疗奶牛乳房炎提供了有利的依据。随着抗生素和合成抗菌药物的限制使用,急需开发能够替代抗菌药物且安全性能好的产品[5]。据研究证实,中药制剂既可防病又能提高生产性能,不但能够直接抑杀病原微生物,而且能够提高机体的免疫机能[13]。另外,中药毒副作用小,在治疗乳房炎方面具有很大发展前景[14]。随着畜牧业的迅速发展和人们对生活质量的提高和绿色食品消费的强烈要求,在寻求防治疾病方面,中药无疑是重要的发展方向之一。

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Comparison of Antibacterial Effects of Six Herb Drug Extracts onStaphy lococcus Aureus in Vitro

DONG Shu-zhen1,FU Zhi-xin1,SONG Yu2,MA Yan-hua3,CAO Wang-bin1

(1.Hebei Normal University of Science&Technology,Changli,066600,China;
2.Environment Management College of China,Qinqhuangdao,066004,China;
3.E&A College of Hebei Normal University of Science&Technology,Qinqhuangdao,066004,China)

To find the optimal drugs for treating the subclinical mastitis of dairy cattle.116 milk samples of 29 dairy cows were collected in Changli country,Hebei province.Positive milk tests were determined using california mastitis Test.Isolation and identification of dominant colony for positive milk were conducted.The antibacterial experiment was proceeded using herb drug extracts ofForsythia suspens,Angelica sinensis,Flos lonicerae,Vacca segetalis,Taraxaci mongolicum,Ligusticumwallichii,et al.The results showed thatStaphylococcus aureuswas the dominant baacterium.15 cases were diagnosed as cow mastitis,the positive rate reached 51.7%(15/29),30 of 116 milk teats were positive,the positive rate was 25.9%(30/116).The whole herb drugs had antibacterial effect forStaphylococcus aureus.Forsythia suspensextracted by 75%alcohol had best antibacterial effect.

subclinical mastitis;Staphylococcus aureus;herb drug extract;in vitroantibacteria;dairy cow

S853.73;S852.612

B

1007-5038(2010)08-0121-04

2009-12-31

董淑珍(1967-),女,河北蔚县人,实验师,主要从事动物组织胚胎病学研究。