串珠镰刀菌素对仔猪部分免疫指标的影响*

黄露菡,王 凯,唐兆新,魏文康

((1.华南农业大学,广东广州 510640;2.佛山科学技术学院,广东佛山 528231;3.广东省农业科学院兽医研究所,广东广州 510640)

串珠镰刀菌素对仔猪部分免疫指标的影响*

黄露菡1,王 凯2*,唐兆新1,魏文康3

((1.华南农业大学,广东广州 510640;2.佛山科学技术学院,广东佛山 528231;3.广东省农业科学院兽医研究所,广东广州 510640)

12头40日龄三元杂仔猪,平均初体重12 kg±0.5 kg,随机分成两组,每组6头,以研究串珠镰刀菌素对仔猪免疫功能影响。对照组喂饲正常饲料,试验组在饲料中按 30 mg/kg添加串珠镰刀菌素(MON)提取物。试验期为42 d,每周清晨空腹抽血1次。结果发现,试验组在攻毒后的第1周血液中T淋巴细胞数量与对照组相比差异不显著,第2、3、4、5、6周显著下降(P＜0.01)。试验组T淋巴细胞转化能力在第1,2,3周与对照组相比差异不显著,第4、5、6周差异极显著(P＜0.01)。与对照组相比,试验组血清中免疫球蛋白IgG含量在第1周差异不显著,第2、3、4周差异显著下降(P＜0.01)。结果表明,MON可降低仔猪血液中T淋巴细胞数量,T淋巴细胞转化能力及血清中免疫球蛋白IgG含量,从而降低机体抵抗力。

串珠镰刀菌素;仔猪;免疫功能

霉菌毒素污染饲料是当今养猪业面临的一大问题。霉菌毒素能抑制猪的免疫功能,造成动物对感染性疾病的抵抗力下降、诱发慢性感染,或降低疫苗和药物的治疗效果[1]。因此,霉菌毒素污染饲料对养猪业来说是一大潜在危害。其中黄曲霉毒素、赭曲霉素、T-2毒素和脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等对免疫系统破坏作用已被证实。黄曲霉毒素不但影响细胞的应答反应,破坏巨噬细胞的噬菌能力,抑制淋巴细胞的增殖与活化,引起胸腺发育不良和萎缩,同时也影响体液的应答反应,如降低血清免疫球蛋白浓度。另外,单端孢霉烯族毒素是一类强有力的免疫抑制剂,已证明动物接触T-2毒素或脱氧雪腐镰孢菌烯醇后淋巴细胞反应有所减弱,其中包括中性粒细胞趋向性,肺泡巨噬细胞的吞噬作用[2]。在全球范围内,串珠镰刀菌是污染玉米等粮食作物的主要真菌,能产生多种毒素并给人类和动物造成很大危害[3-4]。串珠镰刀菌素(moniliformin,MON)是串珠镰刀菌等20余种镰刀菌所产生的一种水溶性毒素[5-7]。MON对动物有较强的毒性作用,主要作用于增殖活跃的细胞,如肝、脾、心肌、骨骼肌和软骨细胞等。抑制细胞蛋白合成,干扰细胞分裂增殖,对生物膜通透性和各种酶活性有明显影响,同时引起机体过氧化损伤[8]。但关于MON对动物免疫功能影响的研究报道较少,仅见于对鸡的研究,而对仔猪免疫功能影响的研究尚未见报道。因此,本试验结合生产实际情况,旨在研究MON是否影响仔猪免疫功能,为解决猪场免疫失败提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 串珠镰刀菌 从广州某饲料厂原料玉米中分离的串珠镰刀菌作为本试验产毒菌株。

1.1.2 培养液、试剂等 RPMI1640培养液购自GIBICO公司。淋巴细胞分离液,双抗,MTT、ConA均为Sigma公司产品,96孔平底细胞培养板为美国corning公司产品。

1.1.3 IgG测试试剂盒 购自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 试验用动物 40日龄健康五元杂仔猪12头,平均初体重12 kg±0.5 kg,其中公猪6头,母猪6头。

1.2 方法

1.2.1 串珠镰刀菌的产毒培养 将分离到经鉴定为串珠镰刀菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),25℃培养7 d。以灭菌玉米粉为产毒培养基,每250 g干燥玉米粉加水150 mL,拌匀,装入1 000 mL三角瓶中,121℃,45 min高压灭菌,冷却后用灭菌手术刀将PDA平板划碎成小块接种于产毒培养基上,摇匀。置25℃培养10 d后,转4℃培养7 d,再转25℃培养10 d。

1.2.2 串珠镰刀菌素的提取与纯化 经过27 d的培养,选择生长良好的串珠镰刀菌产毒培养基,115℃高压灭菌15 min,烘干。将培养物用中药粉碎机粉碎。取粉碎后的培养物20 g于300 mL具塞锥三角瓶中,加入150 mL二氯甲烷振荡2 min,过滤弃去二氯甲烷,再加 150 mL二氯甲烷振荡15 min,同样弃去二氯甲烷。然后向样品中加入100 mL乙腈∶水((95∶5)振荡 30 min,过滤,收集滤液50 mL于250 mL分液漏斗中,加入同体积的正己烷振摇2 min,待分层后弃去正己烷层,将乙腈水层再分别用20 mL正己烷提取2次,收集乙腈水层于圆底烧瓶中,50℃水浴中旋转蒸发减压蒸干,加入0.5 mL甲醇溶解残渣。

1.2.3 毒素鉴定 分别将MON标准品(Sigma公司产品)和提取物进行高效液相色谱仪检测(用紫外监测器,波长254 nm,柱温35 ℃)。

图1 MON标准液高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography for MON standard substance

1.2.4 攻毒试验 试验动物饲喂广东某饲料厂生产的仔猪全价日粮。经1周适应性饲养后,随机分成试验组(n=6)和对照组(n=6)。在试验攻毒前先空腹抽血,检测各项待测免疫指标,无显著差异后进行攻毒试验。试验组饲料中添加MON提取物(MON含量为30 mg/kg)。两组试验动物均在相同条件下饲养 42 d,于试验第 7、14、21 、28、35、42 天清晨空腹进行前腔静脉抽血,每次采血 7 mL,用38 g/L枸橼酸纳溶液抗凝。其中2 mL用于淋巴细胞转化试验,0.5 mL用于 T淋巴细胞值的测定,4.5 mL抗凝血以3 000 r/min 10 min分离血浆,分装,置-70℃超低温冰箱保存待测。

1.2.5 测定指标和方法 T淋巴细胞值的测定采用酸性非特异性酯酶染色法。淋巴细胞转化率测定采用四甲基偶氮唑盐(MT T)颜色反应比色法。IgG含量测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)。

1.2.6 数据处理 所有数据以平均数±标准误表示,用SPSS10.0统计软件进行独立样本t检验。

2 结果

2.1 高效液相色谱图

如图1和图2所示,结果表明,在本试验所采用的条件下,MON标准液的出峰时间为12.80 min;提取液在12.84 min有出峰,表明提取液中含有MON。

图2 提取液高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatography for MON extract

2.2 T淋巴细胞值

结果见图3。可知整个试验中,对照组仔猪血液中T淋巴细胞值变化不大,试验组则出现明显的下降趋势,从攻毒后第2周开始至第6周,对照组和试验组血液中T淋巴细胞值差异极显著(P＜0.01)。

2.3 T淋巴细胞转化率

结果见图4,可知在试验开始的第1周和第2周,试验组淋巴细胞转化率略高于对照组,但差异不显著。第3周开始,试验组淋巴细胞转化率呈现下降趋势,转化率低于对照组,第4,5,6周时对照组与试验组淋巴细胞转化率出现差异极显著(P＜0.01)。

2.4 IgG含量测定

结果见图5。在试验第2,3,4周,试验组血液中IgG含量呈现明显下降趋势,对照组与试验组差异极显著(P＜0.01)。

图3 T淋巴细胞计数Fig.3 T lymphocy te count

图4 淋巴细胞转化率Fig.4 Lymphocy te transformation rate

图5 血清中IgG含量Fig.5 IgG concentration in serum

3 讨论

至今为止,有关串珠镰刀菌素对免疫功能的影响报道很少,仅有的几篇报道主要集中于对鸡的研究。Dombrink Kurtzman M A等[9]给小鸡饲喂含MON 66 mg/kg～367 mg/kg的饲料一段时间后,可引起血液学上的一系列改变。表现在血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数的明显减少,血沉降低,且外周血出现了异常红细胞。Qureshi M A等[10]报道MON具有一定的免疫抑制作用,给小鸡含MON 42.7 mg/kg的饲料6周后可引起血清IgG水平降低,巨噬细胞的吞噬功能降低34%。王凯等[11-12]报道,MON会影响鸡免疫器官的生长发育,造成鸡的免疫病理损伤,血清中IL-2含量减少,血液中T淋巴细胞比例下降,T淋巴细胞转化率降低。这与本次试验结果相一致。

T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分,来源于骨髓的多能干细胞,具有多种重要的生物学功能。T淋巴细胞主要是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答,并具有清除细胞内寄生菌效应的作用。效应CTL可直接杀伤靶细胞,发挥特异性细胞免疫功能,Th辅助或抑制B细胞产生抗体,并分泌多种细胞因子。本研究发现,试验组仔猪血液中 T淋巴细胞数量呈现明显下降趋势,由此说明串珠镰刀菌素对 T淋巴细胞的生成有明显抑制作用,从而抑制细胞免疫功能。

T淋巴细胞转化试验是用于显示淋巴细胞受到外来抗原攻击的反应能力,其转化能力高低反应机体细胞免疫功能状态。当细胞免疫缺陷时,转化率显著降低,甚至看不到转化现象。患恶性肿瘤或其他疾病时,这种转化功能也降低,而具有强烈致癌作用,黄曲霉毒素对细胞免疫就具有显著抑制作用。本试验结果表明,MON可抑制T淋巴细胞对外来刺激物免疫应答水平,从而减弱机体细胞免疫功能,增加机体对疾病的易感性。

IgG主要由脾、淋巴结中的浆细胞合成和分泌,是介导体液免疫的主要抗体。其以单体形式存在,是血清中的主要抗体,具有吞噬、凝集、沉淀抗原,中和病毒和毒素的作用。IgG在抗体介导的抗细菌、抗病毒、抗外毒素等多种免疫防御机制中起着重要作用。IgG是惟一能从母体通过胎盘转移到胎儿体内的免疫球蛋白,是胎儿和新生儿抗感染免疫的主要物质基础。本研究表明,在试验的 2、3、4周,试验组血液中IgG含量呈现明显下降趋势,对照组与试验组差异极显著。说明试验组仔猪机体合成和分泌IgG功能降低。由此可知,MON可使仔猪机体体液免疫功能下降,降低机体抵抗力。

本研究表明,MON可通过降低仔猪血液中 T淋巴细胞数量,T淋巴细胞转化能力以及血清中免疫球蛋白IgG含量,减弱机体的细胞免疫功能和体液免疫功能,从而增加动物对疾病的易感性。

[1]敖志刚.养猪生产中的霉菌毒素没有安全限量[J].养猪,2009(2):6-8.

[2]计 成.霉菌毒素与饲料食品安全[M].北京:化学工业出版社,2007:58-60.

[3]赵献军,汪昭贤,曹光荣,等.串珠镰刀菌素对雏鸡的毒性研究[J].西北农业学报,1998,7(4):36-38.

[4]刘 江.串珠镰刀菌素与镰刀菌素的研究进展[J].国外医学:卫生学分册,1996,23(6):351-356.

[5]Rabie C J,Marasas W F O,Thiel P G,et al.Moniliformin production and toxicty of different fusarium species from southern Africa[J].Environ Microbiol,1982,43:517-521.

[6]Chelkowski J,Zawadzki M,Zajkowski P,et al.Moniliformin production byFusariumspecies[J].Mycotoxin Res,1990,6:41-44.

[7]Marasass W F Thiel P G,Sydenham E W,et al.Toxicity and moniliformin production by four recently described species ofFusaniumand two uncertain taxa[J].Mycopathologia,1991,113(3):191-197.

[8]赵献军.串珠镰刀菌研究进展[J].动物医学进展,2002,23(4):19-22.

[9]Dombrink Kurtzman M A,Javed T.Serohematologic alterations in broiler chicks on feed amended withFusarium proli feratumculture material on fumonision B1 and monilifo rmin[J].J Vet Diag n Invest,1995,7(4):520-526.

[10]Qureshi M A,Garlieh J D,Hagler W M,et al.Fusarium prolif eratumculture material alters severa;production and immune performance parameters in white Leghorn chickens[J].Immunopharmacol-Immunotoxicol,1995,17(4):791-804.

[11]王 凯,杨丽梅,何永明,等.串珠镰刀菌素的培养提取及对鸡的免疫病理损伤[J].畜牧与兽医,2007,39(9):29-32.

[12]王 凯,杨丽梅,黄庆敏,等.串珠镰刀菌素对鸡血清白介素 2含量的影响[J].中国兽医学报,2008,28(9):1081-1083.

Effects of Moniliformin on Immune Indexes in Piglets

HUANG Lu-han1,WANG Kai2,TANG Zhao-xin1,WEI Wen-kang3

(1.South China Agriculture University,Guangzhou,Guangdong,510640,China;2.Foshan Science and Techology Collegee,Foshan,Guangdong,528231,China;3.Guangdong Institute of Veterinary,Guangzhou,Guangdong,510640,China)

12 crossbred piglets at 40 days were randomly divided into 2 groups,each with 6 piglets,mean weight 12 kg±0.5 kg.To study moniliformin effect on the immune function of piglets,the control group were fed with basal diets.In the treatment group,piglets were fed with diets added 30 mg/kg MON.The trail lasted for 42 days.The blood were collected per week for investigating the effects of MON on immunological function.The result indicated that no significant difference on T lymphocyte count between control group and treatment group in the first week.But in the second week to the sixth week,T lymphocytes were significantly decreased(P＜0.01)in the treatment group.T he treatment group had no significant difference compared with the control group at lymphocyte transformation rate in the early three weeks.But T lymphocyte transformation rate had very significant difference(P＜0.01)between control group and treatment group from the fourth week to the sixth week.Serum IgG concentration in treatment group was significantly lower(P＜0.01)than that in the control group in the second week to the sixth week.In conclusion,MON can decrease the T lymphocyte count,lymphocyte transformation rate and serum IgG in piglets.

moniliformin;piglets;immunological function

S856.9

A

1007-5038(2010)08-0064-05

2010-01-06

黄露菡(1984-),女,广东潮州人,硕士研究生,主要从事临床兽医学研究。*通讯作者