猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定和药敏试验*

徐引弟,王治方,朱文豪,梁 跃,郭成留

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州 450002)

猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定和药敏试验*

徐引弟,王治方,朱文豪,梁 跃,郭成留

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州 450002)

从2006年-2009年河南省发生的猪高热综合征的168家规模化猪场456份病料中分离出革兰阴性小杆菌,通过培养特性、生化试验和PCR检测,结果鉴定出25株猪支气管败血波氏杆菌。结果显示,所分离的猪支气管败血波氏杆菌对小鼠均有毒力,对阿齐霉素、环丙沙星、阿米卡星敏感。

猪支气管败血波氏杆菌;分离;鉴定;药敏试验

支气管败血波氏杆菌 (Bordetella bronchi-septica,Bb)可引起猪发生非进行性萎缩性鼻炎(non-progressive atrophic rhinitis,NPAR)和支气管肺炎,也是猪呼吸道综合征(Porcine respiratorydisease complex,PRDC)的重要致病因子之一[1-2]。断奶前仔猪感染Bb,可发生NPAR和支气管肺炎,引起鼻甲骨萎缩。断奶后仔猪感染主要表现为打喷嚏及鼻塞,不产生或者只产生轻度的鼻甲骨萎缩。这两种情况下如果继发了产毒多杀性巴氏杆菌,则会发生更严重的进行性萎缩性鼻炎[3-4]。2006年6月以来我国暴发的高热综合征给养猪业造成了巨大经济损失,高热综合征主要由高致病性猪蓝耳病病毒引起,同时有圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒和伪狂犬病毒的感染,细菌性病原如猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠埃希菌、波氏杆菌、巴氏杆菌等继发感染和混合感染,波氏杆菌是主要的细菌性感染之一[5-8]。

本试验通过对河南省规模化猪场猪支气管败血波氏杆菌的分离鉴定和药敏试验,为预防和控制该病的流行提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 从2006年9月至2009年12月河南省发生的高热综合征的168个猪场共采集的病猪的肺、心血、脑、脾脏、淋巴结等共456份病料。

1.1.2 主要试剂及仪器 TSA(T ryptic soy agar)、TSB(Tryptic soy broth)购自 Difco公司;麦康凯(MC)琼脂、革兰染色液购自郑州理利生物公司;生化管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司;TaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司;凝胶成像系统、电泳仪均为Bio-Rad公司产品;PCR仪为Touchgene公司产品;CO2培养箱、超低温冰箱均为REVCO产品;E200-F三目生物显微镜为Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离纯化 将病料接种于加血清和NAD的TSA培养基,置于体积分数为5%的CO2培养箱,37℃培养过夜,挑取圆形、透明、直径1 mm～2 mm的粉红色可疑菌落。取上述菌落抹片革兰染色后在显微镜下观察,挑取革兰阴性小杆菌菌落于TSA平皿纯化。

1.2.2 生化试验 对可疑菌落进行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇、卫矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、谷氨酸脱羧酶、枸橼酸、明胶、甲基红、VP、吲哚半固体等生化试验。

1.2.3 PCR鉴定 将上述初步鉴定的细菌进一步用PCR方法确定。用接种环取少许被检菌落于100 μ L无菌 PBS,混匀 ,取 1 μ L 菌悬液作 PCR 模板。参照文献[9],根据波氏杆菌 fla基因(NO.AF232939)序 列 设 计 引 物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,扩增片段大小为 235 bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应 体 系(50 μ L):10 ×缓冲 液 5 μ L,2 mmol/L dNTPs 1 μ L,10 μ mol/L 上下游引物各 1 μ L,TaqE 1 μ L,模板 1 μ L,灭菌 ddH2O 40 μ L 。 反应 条件:94℃变性4 min;94℃1 min,59℃1 min,72℃30 s,共35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳。PCR产物回收后测序。

1.2.4 小鼠毒力试验 将分离菌株接种TSB培养基,37℃、250 r/min振摇培养12 h。用生理盐水稀释菌数约为109cfu/mL,小鼠腹腔注射0.2 mL;同时设生理盐水阴性对照。接种后观察发病及死亡情况,剖检小鼠,无菌取其心血分离细菌并鉴定。

1.2.5 药敏试验 将分离鉴定好的菌接种于TSA平板,涂匀、选取相应的抗生素的药敏纸片贴于培养基上。于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养12 h,测量抑菌环直径并判定结果。

2 结果

2.1 培养特性与镜检

在TSA培养基上长成直径1 mm～2 mm灰白、透明光滑菌落,在血平皿上灰白色不溶血小菌落,在MC培养基生长良好,呈微红色,直径1 mm～1.5 mm不透明粉红色菌落。革兰染色均为阴性短杆菌或球杆菌,多散在,极少呈短链状。

2.2 生化试验

所有碳水化合物发酵试验均为阴性,氧化酶、脲酶、柠檬酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、谷氨酸脱羧酶、枸橼酸阳性,有运动性,硝酸盐还原、吲哚、甲基红、VP阴性,不液化明胶。结果表明,分离的可疑菌符合猪支气管败血波氏杆菌的生化特征。

2.3 PCR鉴定

对上述经鉴定的可疑菌进行猪支气管败血波氏杆菌的PCR鉴定,产物经琼脂糖凝胶电泳,证实大小均与预期大小一致(图1)。PCR产物经测序分别与波氏杆菌fla基因(NO.AF232939)序列100%同源性(序列略)。测序结果表明所扩增序列同源性高,引物设计合理,可用于病原菌的快速鉴定。

综合以上鉴定结果,共鉴定出猪支气管败血波氏杆菌25株,其中分离自肺21株,心血4株。

图1 Bb PCR扩增结果Fig.1 PCR results of Bb

2.4 小鼠毒力试验

接种小鼠24 h内死亡,取死亡鼠心血接种MC琼脂平皿。结果分离出纯的经鉴定与以上一致的细菌,证明为猪支气管败血波氏杆菌并对小鼠有致病性。

2.5 药敏试验

从药物敏感试验结果看,对大部分猪支气管败血波氏杆菌敏感的药物有阿齐霉素、环丙沙星、阿米卡星。而对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、青霉素G、氨苄西林、万古霉素、氯霉素、新霉素、阿莫西林、克林霉素、链霉素、复方新诺明、庆大霉素、四环素、痢特灵等抗菌药物的敏感度低。

3 讨论

本试验从2006年9月至2009年12月河南省发生高热综合征的168家猪场共采集的456份病料中,共分离到25株猪支气管败血波氏杆菌。在所有分离的致病菌中排第 4(排在链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠埃希菌之后),是高热综合征细菌性病原的四大病原之一[10],与文献[11]的报道一致。从所采取的病料看,由于高热综合征主要表现在呼吸道,关节肿大跛行、后肢瘫痪的病例较多,部分病例出现神经症状,因此采取的肺病料较多,其次为心血、关节液,而波氏杆菌主要分离自肺。从混合感染或继发情况看,某一个猪场或某一头猪或单独一个脏器只感染单一细菌的情况较少,多数为2种、3种细菌混合感染,甚至 4种以上细菌混合感染的情况。单独感染波氏杆菌的情况很少,波氏杆菌主要与副猪嗜血杆菌、链球菌、大肠埃希菌、巴氏杆菌等混合感染。尽管体外药敏试验能找到少数对几种主要病原菌敏感的药物,但是这些不能完全替代体内的试验结果,而且由于混合感染和多重感染的普遍存在,使得这些体外敏感的药物在临床上使用效果不佳。另外,由于大部分猪场长期在饲料或饮水中添加或注射多种大量的抗生素,使得细菌的抗药性越来越强。

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[6]宁宜宝,郑 杰,张纯萍,等.我国南方猪高热病的研究(Ⅱ)—猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离、鉴定和致病性测定[J].中国兽药杂志,2007,41(1):14-18.

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[10]徐引弟,王治方,蔡旭旺,等.河南省规模化猪场高热综合征细菌性病原的分离鉴定[J].河南农业科学,2010(1):116-118.

[11]赵战勤,裴 洁,薛 云,等.猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].中国农业科学,2008,41(12):4209-4217.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofBordetella bronchiseptica

XU Yin-di,WANG Zhi-fang,ZHU Wen-hao,LIANG Yue,GUO Cheng-liu

(Institute for Animal Husbandry and Veterinary Research,Henan Acadmy of Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan,450002,China)

Gram negative small bacilli were isolated from 456 samples of 168 pig farms in Henan province which had high fever syndrome from 2006 to 2009.These strains were identified base on culture characteristics,biochemical and PCR assay.The result showed that there were 25Bordetella bronchiseptica(Bb)strains.The virulence and drug sensitivity test results showed that these Bb strains were lethal to mice and sensitive to azithromycin,ciprofloxacin and amikacin.

Bordetella bronchiseptica;isolation;identification;drug sensitivity test

S858.28

B

1007-5038(2010)08-0110-03

2010-03-01

资金项目:河南省科技攻关项目(072102140004);河南省农科院孵化项目(200712)

徐引弟(1974-),女,湖北浠水人,副研究员,博士,主要从事动物病原微生物学研究。