冬虫夏草对糖尿病大鼠纤溶系统的影响

陈 叶 傅余芹 方华伟 韩亚莉 杜月娟

(山东大学第二医院肾内科,山东 济南 250012)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的最常见、最严重的并发症之一,严重威胁人类的健康。关于 DN的发病机制,目前认为高糖造成的肾脏血流动力学改变及葡萄糖本身代谢异常所致的一系列后果是造成肾脏病变的基础,其中肾脏细胞外基质(ECM)蓄积引起的肾小球硬化与间质纤维化是 DN发展至终末期肾衰竭的主要病理表现。ECM是细胞外大分子构成的网络,主要包括胶原、层黏连蛋白及纤维连接蛋白等,其过度堆积或降解减少均视为病理性重塑,是肾脏病变发生发展的主要原因。生理状态下,ECM受各种因子的调节保持生成和降解的平衡,其中主要为金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、纤溶酶原等,而纤溶酶原激活后不仅能直接降解细胞外基质,还能激活金属蛋白酶间接降解基质,处于各种调节酶系的上游,发挥更为重要的作用。冬虫夏草(CS)为我国传统名贵中药,具有补肺肾、止咳嗽、益虚损、养精气之功能,但其保护肾脏的具体机制尚未完全明了,本研究观察CS干预对局部纤溶系统紊乱的作用,揭示其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级 8周龄雄性 Wistar大鼠 44只,体重(180±10)g,山东大学医学院实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 虫草菌丝粉由杭州中美华东制药有限公司提供。链脲佐菌素(STZ)购自 Sigma公司。兔抗大鼠纤溶酶原激活物(t-PA)抗体为博士德产品;兔抗大鼠纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI)、兔抗大鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)抗体为美国 Santa-Cruz公司产品;兔抗大鼠纤维连接蛋白(FN)为北京中杉金桥生物有限公司产品。

1.3 动物模型的建立与分组 大鼠适应性喂养 1 w后随机分为正常对照组 10只,模型组 12只,CS早期干预组 11只,CS晚期干预组 11只。模型组大鼠给予STZ 55 mg/kg体重腹腔内注射,STZ粉末用 pH4.5的柠檬酸缓冲液溶解,正常对照组给予同等剂量的柠檬酸缓冲液腹腔内注射。72 h后给予尾静脉采血测血糖,凡随机血糖在 16.7 mmol/L者视为糖尿病模型成功(其中有1只未成模型)。CS干预组造模同模型组,早期干预组大鼠于成模后即开始每天给予CS粉末混悬液 5.0 mg/kg/体重灌胃,晚期干预组于成模后 4w开始灌胃,CS剂量同早期组。正常组和模型组的大鼠分别给予等量的清水的灌胃。在饲养过程中,模型组死亡 2只,早期干预组死亡 1只。

1.4 血生化指标检测及形态学观察 于 12 w时测大鼠体重、24 h尿蛋白(代谢笼收集 24 h尿)、血糖,处死大鼠,眼眶取血测肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。取左肾称重,常规脱水,石蜡包埋,HE染色观察肾脏的组织学变化。

1.5 免疫组化检测 免疫组化法检测肾脏 t-PA、PAI、FN及ColⅣ表达。免疫组化采用卵白素-生物素复合物 (ABC)技术。主要步骤如下:组织经常规脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化后,用 3%过氧化氢避光封闭 20 min;枸橼酸水浴修复,正常山羊血清封闭 20 min,滴加不同浓度的一抗;4℃过夜,滴加生物素标记的二抗,37℃ 20 min,滴加 ABC,37℃ 20 min,滴加显色剂 DAB,发现组织已经染色后马上用蒸馏水冲洗中止显色。苏木素复染、常规脱水、透明、封片。采用北京航空航天大学计算机中心提供的医学彩色图像分析软件,分析每只小鼠的肾脏皮质组织化学染色片,100倍显微镜下,视野上、下、左、右、中各任意取 2个肾小球(共 10个肾小球)进行分析,计数单位面积肾小球内免疫组化阳性组织所占的比例。

1.6 统计学处理 采用 SPSS17.0软件包,各组数据以 x±s表示,采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 一般情况和生化指标的变化 注射 STZ后大鼠出现多饮,多食,多尿,消瘦,皮毛无光泽,活动反应差,CS干预后一般情况有所好转,早期干预组效果较晚期组为好。12 w时,模型组、CS干预组体重较正常组明显减轻,Scr、尿蛋白、血 BUN、肾重/体重明显升高(P＜0.01),提示造模成功。干预组除血糖外,余指标都较模型组改善(P＜0.01或 P＜0.05),见表 1。

2.2 肾脏病理组织结果 光镜下,HE与 PAS染色均显示,与正常对照组比较,模型组与干预组肾小球截面积增大,系膜区增宽,部分有结节性沉积物,毛细血管壁基底膜增厚,部分肾小管扩张,伴空泡样变性,部分肾小管萎缩,伴单核细胞,淋巴细胞浸润。干预组上述病变减轻,早期干预组更明显,见图 1。

2.3 肾组织中 t-PA、PAI、FN及 ColⅣ蛋白表达的变化 免疫组化染色显示,大鼠肾组织中的 t-PA、PAI主要分布在肾小管基底膜,除部分肾小球系膜区可有少量着色,肾小球基本无分布。FN、ColⅣ主要分布在肾小球系膜区,毛细血管基底膜,肾小球囊壁,肾小管基底膜等。与正常对照组比较,PAI、FN和ColⅣ在模型组均增高(P＜0.01),干预后减轻,早期干预较晚期干预效果好;t-PA在模型组、干预组均减少(P＜0.01),模型组更明显,见表 2。

图1 肾脏病病理组织图片(×400)

表1 12 w末各组大鼠生化指标(x±s)

表2 各组大鼠 t-PA、PAI、FN及 ColⅣ蛋白表达比较(x±s,%)

3 讨 论

近年来,DN已成为慢性肾衰竭的主要病因之一。目前认为,除了高糖造成肾脏血流动力学改变以及葡萄糖本身代谢异常所致的外,ECM积聚引起的进行性肾小球硬化与间质纤维化是 DN进行性恶化的主要原因。而引起 ECM积聚的原因在早期主要为合成增多,晚期主要为降解减少。

纤溶酶原纤溶系统是肾小球 ECM的主要降解酶系统,除了可直接降解 ECM外,还能将基质金属蛋白酶原分解为基质金属蛋白酶 (MMPs)〔1〕,处于基质降解级联的上游,在 ECM降解中,较其他酶更为重要。纤溶酶原激活物分为组织型 (t-PA)与尿激酶型 (u-PA)。t-PA主要参与肾小球及血管内血栓溶解及基质溶解,u-PA主要参与肾小管间质的基质降解。PAI-1是纤溶酶原激活物的生理性抑制剂〔2,3〕,在结缔组织演变、凝血、纤溶、补体激活和炎症反应等过程中具有抑制蛋白降解的作用。维持两者正常的比例对细胞形态的维持,细胞与其间质的黏附,细胞增殖,信号转导及信号表达等都有重要意义〔4〕。

糖尿病时高血糖,高胰岛素可以上调 2型糖尿病患者PAI-1的表达,并与肾损害 (尿蛋白)的程度成正相关〔5〕,体外培养的系膜细胞与糖基化终末产物 (AGE-BSA)共孵育也有相似的结果〔6〕。高糖可以通过激活 NF-k B,从功能和 mRNA转录水平促使 PAI-1/tPA功能紊乱,导致纤溶酶活化减少,ECM降解受到抑制〔7〕。本研究也证实,糖尿病时,PAI的表达量较正常对照组明显增多,FN、COLⅣ等ECM主要成分均增多。同时伴有t-PA表达量的减少。光镜病理显示肾小球肥大,细胞外基质增多,肾小管萎缩,有单核,淋巴细胞浸润。

CS是我国传统的名贵中药,主要成分为粗蛋白、粗脂肪酸、D甘露醇、尿嘧啶、麦角菑醇、燂糖等,具有多种保健和药用活性,研究证实虫草及人工虫草对肾脏均具有保护作用。虫草可明显降低 5/6肾切除模型鼠尿素氮及肌酐水平,阻抑肾小球的代偿性肥大,明显减轻肾脏病理改变,尤其是对肾小管间质的病变有明显的防治作用〔8〕。长期服用虫草醇提取液能延缓肾功能衰竭大鼠的肾功能减退,减轻蛋白尿,纠正氨基酸,蛋白质和脂质代谢紊乱。CS对氨基糖甙所致肾脏氧耗下降,减轻氨基糖甙溶酶体损伤及脂质过氧化损伤,降低组织钙含量,以及对损伤状态下肾内肾组织表皮生长因子调节的保护,促进肾小管的再生修复有关〔9〕。本研究也证实 CS干预后,DN大鼠一般情况较模型组好转,血肌酐,尿素氮减少,肾脏病理改变减轻。t-PA/PAI紊乱得到部分纠正,提示虫草治疗DN的机制之一为纠正纤溶酶原系统的紊乱,且早期干预较晚期干预效果好。至于CS中的具体什么成分起作用,有无副作用,多大剂量为最佳治疗量,还需要进一步的研究。

1 Cho SH,Ryu H,Oh CK.Plasminogen activator inhibitor-1 in the pathogensis of asthma〔J〕.Exp Biol Med,2004;229:138-46.

2 Look MP,van Putten WL,Duffy MJ,et al.Pooled analysis of prognostic impact of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1in 8377 breast cancer patients〔J〕.J Natl Cancer Inst,2002;94(2):116-28.

3 Aucella F,Margaglione M,Vigilante M,et al.PAI-1 4G/5G and ACE I/D gene polymorphism and the occurrence of myocardial infarction in patients on intermittent dialysis〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2003;18(6):1142-6.

4 Kutz SM,Nickey SA,White LA,et al.Induced PAI-1 mRNA expression and targeted protein accumulation are early G1 events in serum-stimulated rat kidney cells〔J〕.Cell Physiol,1997;170(1):8-18.

5 Hirano T,Kashiwazaki K,Moritono Y,et al.Albuminuria is directly associated with increased plasma PAI-1 and factorⅦlevels in NIDDM patients〔J〕.Diabetes Res Clin Pract,1997;37(1):11-8.

6 郑义彬,陈香美,叶一舟,等 .糖基化终末产物对肾小球系膜细胞表达纤溶酶原激活物抑制剂 1的影响〔J〕.中华医学杂志,1997;7(9):672-5.

7 陈丽萌,李学旺,林嘉友,等 .洛伐他汀对高糖时人肾小管上皮细胞核因子-kV与组织纤溶酶原激活物及其抑制物的作用〔J〕.中华肾脏病杂志,2001;17(6):399-403.

8 刘 强,侯积寿,马济民 .虫草影响慢性肾功能衰竭进展的实验研究〔J〕.中华肾脏病杂志,1995,11(2):81-2.

9 黎磊石,郑 丰,刘志红,等 .冬虫夏草防治氨基糖甙肾毒性损伤的实验研究〔J〕.中国中西医结合杂志,1996,16(12):733-7.