山楂中熊果酸和齐墩果酸的高效液相色谱分析

周巧霞， 顾振纶

（1.苏州九龙医院药剂科，江苏苏州 215021;2.苏州中药研究所，江苏 苏州 215007）

山楂为蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥果实，具有消食健胃.行气散瘀作用。用于肉食积滞，胃腕胀满，瘀血经闭，高脂血症［1］。现代药理研究表明熊果酸和齐墩果酸是山楂降血脂的主要活性成分，且含量较高［2］。熊果酸和齐墩果酸为一对异构体，含量测定多采用高效液相色谱法［3，4］，但在检测过程中发现两组分分离效果不好且拖尾因子过大。本文建立的反相高效液相色谱法很好的解决了这两点，并对3个批号的样品进行了含量测定，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters510高效液相色谱仪（WDL－95色谱工作站，Waters484紫外检测器，Waters7725i进样阀）;Sartorius BS110S电子天平（万分之一）;PHS－3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）。二蒸水;四丁基氢氧化铵、磷酸盐等均为分析纯;甲醇为色谱纯。熊果酸和齐墩果酸含量测定用对照品（0742－9909和 110709－200505）购自中国药品生物制品检定所;山楂提取物为本所自制。

1.2 样品制备

对照品溶液:取熊果酸和齐墩果酸对照品约12 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液:取山楂提取物约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.3 色谱条件 分析柱采用μBandapakTMC18柱，300 mm×3.9 mm ID，10 μm粒径（美国Waters公司）;流动相为pH3.5的甲醇/磷酸盐缓冲液（85/15含0.4%四丁基氢氧化铵），波长215 nm，流速1.0 mL/min，柱温:40℃。

2 结果

2.1 pH的影响 分别配制pH值为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸盐缓冲液/甲醇为50/50的流动相，按上述分析方法分离样品溶液。结果表明:pH在3.5时熊果酸和齐墩果酸的峰形和分离度较好;pH升高，峰形变窄、保留时间缩短，但熊果酸与齐墩果酸部分重叠;pH降低，峰形变宽、保留时间延长。故选择pH为3.5左右。

2.2 四丁基氢氧化铵的影响 分别配制含四丁基氢氧化铵为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%（v/v）的流动相，按上述方法分析样品溶液。结果表明:四丁基氢氧化铵浓度由0.2%增加到0.4%时，峰形变窄、拖尾因子变小;由0.4%增加到0.6%、0.8%时，峰形和拖尾因子无明显变化。故选用四丁基氢氧化铵浓度为0.4%。

2.3 甲醇浓度的影响 配制甲醇/磷酸盐缓冲液不同比例的流动相，按上述方法分析样品溶液。结果表明:甲醇比例在85%时，既保持了良好的峰形、分离度和拖尾因子，又有合适的分析时间，故选择甲醇/磷酸盐缓冲液为85/15。

2.4 标准曲线 精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 μL分别注入高效液相色谱仪测定峰面积，以质量对峰面积回归得标准曲线方程。熊果酸:Y=51 024X+996 0（r=0.999 8），线性范围为0.82～4.1 μg;齐墩果酸:Y=48 839X+6 932（r=0.999 9），线性范围为0.80 ～4.0 μg。

2.5 精密度 用以上色谱条件将对照品溶液和样品溶液连续进样5次，熊果酸的RSD为0.57%，齐墩果酸的RSD为0.52%。

2.6 重现性 制备供试品溶液5份，各吸取5 μL进样分析，计算含量。熊果酸的RSD为0.75%，齐墩果酸的RSD为0.68%。

2.7 稳定性 取供试品溶液分别于配制后0、1、3、5、21、23、25 h依法测定，熊果酸的RSD为1.45%，齐墩果酸的RSD为1.25%。

2.8 回收率 采用加样回收（n=5），精密称取已知含量山楂提取物10 mg，精密加入熊果酸对照品液10 mL和齐墩果酸对照品液3 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，按以上色谱条件测定，计算。熊果酸的平均回收率:98.52%，RSD 1.47%;齐墩果酸的平均回收率:98.13%，RSD 1.61%。

2.9 样品分析 取三批山楂提取物，按供试品溶液制备项下配制，测定含量，结果见表1、图1和图2。

表1 山楂提取物中熊果酸和齐墩果酸含量测定

图1 对照品HPLC图谱

图2 山楂提取物HPLC图谱

3 讨论

拖尾因子是高效液相色谱定量分析时非常重要的一个影响因素，特别是在相邻两峰靠得比较近得时候，直接关系定量的准确性。本文方法在建立时尝试了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸盐缓冲液、乙腈－磷酸盐缓冲液等多个流动相，甲醇－磷酸盐缓冲液体系表现出了较好的分离度和峰形，但拖尾因子仍较大。为了解决这一问题，尝试了在甲醇－磷酸盐缓冲液体系中加三乙胺和四丁基氢氧化铵。三乙胺的加入对峰形和拖尾因子没有明显影响，但四丁基氢氧化铵加入后，熊果酸和齐墩果酸的峰形明显变窄、拖尾因子变小。可能的原因是四丁基氢氧化铵加入后与两种成分结合生成离子对，改善了在C18色谱柱上的保留。

在反相柱上甲醇的比例增减对熊果酸和齐墩果酸的保留和分离度有影响。选择的流动相体系既要使两组分能与众多杂质分离，又要保证有合适的分析时间。

经全波长紫外－可见扫描，熊果酸和齐墩果酸的最大吸收波长为207 nm;由于甲醇在此波长处有较强的末端吸收，为了减少干扰又尽量不降低灵敏度，确定在215 nm波长测定熊果酸和齐墩果酸含量。

本法应用时，应注意pH值的稳定，过高或过低都将影响色谱峰的分离度、峰形和拖尾因子，建议将pH值稳定在3.5。流动相长时间放置再使用会导致组分保留时间延长，宜现配现用。

经不同品牌的C18色谱柱测试，方法的重现性较好。本法曾用于不同产地山楂提取物的含量测定，色谱峰的分离度、峰形和拖尾因子均较好。

［1］中国药典［S］.一部.2005:22－22.

［2］阴 健，郭力弓.中药现代研究与临床应用［M］.北京:学苑出版社，1993:101－108.

［3］白雪梅，付煜荣，田嘉铭.高效液相色谱法测定大山楂丸和山楂鲜果中齐墩果酸及熊果酸的含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26（8）:981－982.

［4］黄秋妹，李 宗.HPLC法测定山楂中熊果酸和齐墩果酸的含量［J］. 海峡药学，2007，19（3）:43－45.