壳聚糖用于湘A-1号颗粒剂的絮凝工艺研究

刘诗青，夏新华，彭买姣，李淑辉，邹婉婷

(湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208)

壳聚糖用于湘A-1号颗粒剂的絮凝工艺研究

刘诗青，夏新华*，彭买姣，李淑辉，邹婉婷

(湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208)

湘A－1号颗粒剂;壳聚糖;絮凝澄清工艺;黄芩苷;高效液相色谱法

目的:优选湘A－1号颗粒剂的絮凝澄清工艺。方法:在考察壳聚糖加入量、提取液浓度、pH值、温度、搅拌等因素后，采用正交试验对壳聚糖加入量、提取液浓度、pH值三因素进一步优化。结果:湘A－1号颗粒剂絮凝澄清工艺条件为:壳聚糖加入量0.8 mL/g，提取液浓度1∶6，不调pH值，温度60℃，搅拌速度350 r/min，搅拌15 min。结论:壳聚糖絮凝澄清法可用于湘A－1号颗粒剂的纯化工艺。

湘A－1号颗粒剂主要由黄芩、薏苡仁、虎杖等药材组成，对艾滋病有一定的防治作用。其中，黄芩具有清热燥湿，泻火解毒的作用，其主要成分黄芩苷具有抗菌、消炎之作用。现代药理研究证明，黄芩苷在细胞培养中能抑制HIV逆转录酶和细胞病变，抑制病毒荧光抗原，P24抗原和成人T淋巴细胞白血病病毒，抑制HIV在HO细胞中生长［1］。本研究采用壳聚糖对处方药材水提液进行絮凝澄清，并对澄清工艺条件进行优化。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC－10AT型高效液相色谱仪，岛津SPD－10A型紫外检测器，N－3000色谱工作站;UV1102型紫外/可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);80－1型离心沉淀机(江苏金坛市中大仪器厂);DF－101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)。

1.2 试药黄芩苷对照品(批号110715－200514，中国药品生物制品检定所);壳聚糖(批号20080322，浙江澳兴生物科技有限公司);甲醇(SK Chemicals)为色谱纯;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的测定

2.1.1 样品溶液的制备将处方中各药材按本制剂提取工艺进行提取，并浓缩至一定浓度，即得。

2.1.2 吸光度的测定量取样品溶液适量，以蒸馏水为空白，于650 nm下测定。

2.1.3 固形物保留率的测定分别量取絮凝前后的样品溶液25.0 mL，置于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，干燥至恒重后称定重量，计算。

2.1.4 黄芩苷保留率的测定

色谱条件:色谱柱:Apollo C18－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.2);检测波长:280 nm;流速:1 mL/min;柱温:30℃;理论板数按黄芩苷峰计算不低于2500。

对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.056 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备:精密量取样品溶液5 mL，加5 mL的甲醇，离心10 min，取上清液1 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，用0.45 um微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定黄芩苷峰面积积分值，计算。

2.2 提取液絮凝澄清工艺的优选

2.2.1 壳聚糖溶液的制备取壳聚糖1 g，溶于100 mL 1%的HAc溶液中，静置溶胀24 h，即得。

2.2.2 壳聚糖加入量的考察取浓度为1∶6(生药量g:药液体积mL)的提取液100 mL，平行5份，于磁力搅拌器上加热恒温至60℃，在搅拌速度350 r/min下，分别按0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/g(壳聚糖溶液体积/生药量)加入壳聚糖溶液，搅拌10 min，静置12 h。取上清液于1 cm吸收池，650 nm波长处测定吸光度，结果见图1(a)。可见，当加入量为0.8 mL/g时提取液吸光度最低。

2.2.3 提取液浓度、pH值、温度和搅拌的考察见图1。取提取液适量，壳聚糖加入量为0.8 mL/g，其余按试验设计进行，基本操作同2.2.2项下方法。结果表明，当提取液浓度为1∶6时吸光度最低，见图1(b);pH值在5～8时吸光度较低，其中pH7时吸光度最低，见图1(c);温度为60℃时吸光度最低，见图1(d);搅拌速度为350 r/min，搅拌15 min时，提取液吸光度最低，见图1(e)、图1(f)。

图1 壳聚糖用于湘A-1号颗粒剂絮凝澄清工艺的考察

2.2.4 正交试验优化絮凝澄清工艺在上述试验的基础上，采用正交试验法，以吸光度、固形物保留率及黄芩苷保留率为评价指标，对壳聚糖加入量、提取液浓度、pH值三因素进一步优化，(见表1)，按L9(34)正交表安排试验，其余基本操作同2.2.2项下方法。以吸光度为评价指标，由直观分析(见表2)可知，最佳絮凝澄清工艺条件为A2B3C3，但方差分析表明各因素对吸光度无显著性影响(见表3);以固形物保留率为评价指标，最佳絮凝澄清工艺条件为A1B2C2，但方差分析表明各因素对固形物保留率亦无显著性影响(见表4);而以黄芩苷保留率为评价指标，其最佳絮凝澄清工艺条件为A2B2C1，其中A、C因素经方差分析表明对黄芩苷保留率有显著性影响(见表5);综上，可确定絮凝澄清工艺条件为A2B2C1，即:取1∶6的提取液，加热至60℃，恒温，在搅拌速度为350 r/min下，按0.8 mL/g，缓慢滴加1%壳聚糖溶液，搅拌15 min，静置12 h后滤过，即得。

表1 絮凝澄清工艺正交试验因素水平表

表2 絮凝澄清工艺正交试验结果

表3 吸光度方差分析

表4 固形物保留率方差分析

表5 黄芩苷保留率方差分析

2.3 絮凝澄清法与醇沉法的比较取1∶6的提取液，按上述优选的絮凝澄清工艺条件进行絮凝;另取相对密度约为1.20的提取液，慢加快搅方式加入95%的乙醇，使提取液的含醇量达到50%，于冰箱中静置24 h;分别测定吸光度，并离心、滤过、定容、测定固形物保留率及黄芩苷保留率。结果表明，以黄芩苷保留率为评价指标，絮凝澄清法较醇沉法能更多的保留有效成分(见表6)，经t检验亦显示絮凝澄清法与醇沉法有显著性差异(P＜0.05)。

表6 絮凝澄清法与醇沉法的比较

3 讨论

在中药的纯化工艺中，运用水提醇沉去除中药材提取液中无效成分的同时，也造成了有效成分的大量损失，难以保证成品制剂的有效性，且成品的稳定性较差;而运用絮凝澄清法可选择性的除去无效成分，提高有效成分的含量，保证成品质量的稳定性［2］。甲壳素类澄清剂是近年来应用最为广泛的新型絮凝剂，因其来源广泛、价格低廉、操作简便，安全无毒越来越受到人们的重视。

本实验中，吸光度反映的是提取液经絮凝后，其体系中的悬浮物及胶体粒子的沉降情况，沉降效果越好，上层液越澄清，吸光度越小;固形物保留率反映的是提取液经絮凝后，再经离心滤过去除不溶性物质后所含浸出物的总量。

实验中搅拌应以不起泡沫为度，否则，泡沫难以消失，絮凝杂质会集聚在泡沫周围形成悬浮物，影响后续工艺。对于壳聚糖的用量，应考虑壳聚糖对不同的化学成分的吸附能力差异，尤其对水溶性较小的有效成分，使用壳聚糖作为澄清剂时应当慎重。

［1］徐淑玲，关崇芬，翁新愚，等.扶正祛邪中药复方对猴艾滋病模型实验研究［J］.中国实验方剂学杂志，2003，9(1):42－44.

［2］吴英，侯丽光.中药澄清技术在中药制剂过程中的应用［J］.牡丹江医学院学报，2004，25(4):51－53.

R284.1

B

1001－1528(2010)05－0873－03

2009－05－16

湖南省卫生厅中医药科研专项基金(6201－5)

刘诗青(1985－)，女，硕士研究生，主要从事中药制备工艺及质量标准研究，E－mail:liushiqing86@126.com

*通讯作者:夏新华，男，博士生导师。Tel:(0731)88458305，E－mail:xiaxinhua001@163.com