高效液相色谱荧光法测定大鼠静脉注射桂利嗪的血药浓度

施洁明，何仲贵（1.广州市药品检验所，广州市 510160；.沈阳药科大学药学院，沈阳市 110016）

桂利嗪（Cinnarizine）为二苯哌嗪类钙离子拮抗剂[1]，它直接扩张血管平滑肌，显著改善脑循环和冠循环，该药目前主要用于心绞痛及脑血循环障碍。目前，国内、外对桂利嗪的剂型研究并不完善，《中国药典》现收载的只有片剂和胶囊剂这2种口服固体制剂。而从临床使用方面来看，注射剂起效更快、疗效更好，所以有必要研究和制备桂利嗪注射剂。桂利嗪在水中几乎不溶，而2-羟丙基-ß-环糊精作为新型的注射用辅料对桂利嗪有良好的增溶作用[2]，同时避免了使用有机溶媒所导致的刺激性和毒副作用。笔者在前期成功制备桂利嗪注射剂的基础上，以大鼠为模型动物，采用高效液相色谱荧光法测定了桂利嗪静脉注射给药后的血药浓度，并研究了其在大鼠体内的药动学。

1 材料

1.1 仪器

LC-10AT型高效液相色谱仪、RF-10AXL荧光检测器（日本岛津公司）。

1.2 试药

桂利嗪对照品（广东丽珠集团利民制药厂，批号：20030302，纯度：99.2%）；内标盐酸氟桂利嗪（江西汇仁药业有限公司，批号：000626，纯度：99.5%）；桂利嗪注射液（沈阳药科大学药剂教研室，批号：030508，规格：20 mg·2 mL－1）；乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

1.3 动物

Wistar大鼠，♂，200～250 g，沈阳药科大学实验动物室提供，动物合格证号：SCXK（辽）2003-008。

2 方法与结果

2.1 实验方案

取大鼠6只，禁食过夜，自由饮水。颈静脉插管给药，剂量为3 mg·kg－1。于给药后5、10、20、40、60、120、240 min时静脉取血0.5 mL，肝素抗凝，4000 r·min－1离心10 min，取0.1 mL血浆备用。

2.2 色谱条件[3]

色谱柱：Diamond C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氢铵（50∶50，用磷酸调至pH至5.7）；流速：1.5 mL·min－1；柱温：30 ℃；检测波长：激发波长260 nm，发射波长315 nm；进样量：20 μL。

2.3 对照品贮备液和内标溶液配制

精密称取桂利嗪对照品适量，用甲醇溶解并制成0.1 mg·mL－1贮备液；另取盐酸氟桂利嗪适量，用甲醇溶解并制备成600 ng·mL－1的溶液作为内标溶液。

2.4 血样处理

取0.1 mL血浆置于10 mL具塞玻璃离心试管中，加入内标100 μL和0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液100 μL，用涡旋混合器振荡1 min，加入乙醚1 mL，涡旋振荡2 min，10000 r·min－1离心5 min，收集上清液置于另一具塞玻璃离心试管中，下层液体用乙醚1 mL再提取1次，合并上清液，于40℃水浴中氮气吹干，加入100 μL流动相，涡旋2 min，10000 r·min－1离心2 min，取20 μL进样。

2.5 方法专属性

取空白血浆、空白血浆+内标+对照品、静脉注射后血浆样品（10 min）按“2.4”项下方法处理后进样分析，各色谱峰分离情况见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+内标+对照品；C.血浆样品；1.桂利嗪；2.内标Fig 1 HPLC chromatographyA.blank plasma；B.blank plasma spiked with internal standard and cinnarizine control；C.plasma sample；1.cinnarizine；2.internal standard

图1结果表明，桂利嗪与内标之间分离良好，色谱峰形对称，血浆中内源性物质的色谱峰很小，对桂利嗪和内标的测定无干扰。

2.6 标准曲线的制备

将对照品贮备液制备成不同浓度，加入空白血浆中，使其在血浆中浓度分别为10、50、100、250、500、1000 ng·mL－1，按“2.4”项下操作，记录色谱图、样品峰面积（As）与内标峰面积（Ai）。以R＝As/Ai计算不同浓度的R值，用R对血药浓度C进行线性回归，得标准曲线方程R＝0.0023C+0.0269（r＝0.9996）。结果表明，桂利嗪检测浓度线性范围为10～1000 ng·mL－1。按信噪比为3∶1，最低检测限为0.2 ng·mL－1。

2.7 提取回收率试验

取空白血浆制备含桂利嗪分别为20、500、1000 ng·mL－1的血浆对照样品，每个浓度平行配制5份，按“2.4”项下操作，以提取后的色谱峰面积与同浓度溶液直接进样所得的峰面积之比作为提取回收率。结果，提取回收率分别为95.9%、98.2%、98.6%，RSD分别为1.5%、1.1%、3.2%。取内标溶液100 μL加入到0.1 mL空白血浆中，制备5份，按“2.4”项下操作，以提取后的色谱峰面积与同浓度内标溶液直接进样所得的峰面积之比作为内标提取回收率。结果，内标提取回收率为96.3%，RSD＝1.8%。

2.8 精密度试验

取空白血浆制备含桂利嗪分别为20、500、1000 ng·mL－1的血浆对照样品，按“2.4”项下操作进行分析测定，连续测定3 d。结果日内精密度RSD分别为5.4%、4.7%、6.8%，日间精密度RSD分别为5.1%、3.6%、8.6%。表明日内、日间精密度均符合生物样品分析的要求（RSD＜15%）。

2.9 血浆样品的稳定性考察

制备浓度分别为20、500、1000 ng·mL－1的桂利嗪血浆样品数份，室温放置10 h后按“2.4”项下方法处理后测定，计算桂利嗪浓度。结果3个浓度样品的RSD均＜10%，表明样品在室温条件下10 h内稳定。将上述3个浓度的血浆样品冰冻贮藏，并分别于10、20、30 d取出解冻，按“2.4”项下方法处理后测定。结果3个浓度样品的RSD均＜10%，表明样品在冰冻条件下30 d稳定。另取冰冻贮藏后的3个浓度血浆样品，室温融化，重复冻融3次，按“2.4”项下方法处理后测定。结果3个浓度样品的RSD均＜10%，表明样品在冻融过程中稳定。

2.10 血药浓度及药动学结果

大鼠给药后桂利嗪平均血药浓度-时间曲线见图2。

图2 静脉注射给药后桂利嗪平均血药浓度-时间曲线（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of cinnarizine after intravenous injection（n＝6）

根据消除相末端直线部分的斜率计算t1/2，AUC0～240min由梯形法求得。结果t1/2为（87.73±22.54）min，AUC0～240min为（58453±8672.8）ng·min·mL－1。

3 讨论

3.1 内标物的选择

本文首次采用盐酸氟桂利嗪作为内标物来测定桂利嗪的血药浓度，两者性质和结构均相似，保留时间相近，在本文实验条件下10 min内可获得良好的分离度，且桂利嗪和内标的色谱峰形均令人满意。

3.2 检测器的选择

桂利嗪的给药剂量较小，为每日20 mg，所以血药浓度较低，在紫外检测器下响应值较小，药物进入血液后很快就被消除因而无法检出，以至于无法获得完整的实验数据。笔者利用桂利嗪和内标均具有荧光的特点，选用荧光检测器来提高检测的灵敏度。结果表明，本实验建立的荧光检测法灵敏度高，最低检测限为0.2 ng·mL－1。

3.3 血浆处理条件的选择

笔者曾选用正己烷[4]、氯仿、乙酸乙酯[5]、乙醚等提取溶剂，发现前2种溶剂提取时易发生乳化现象，乙酸乙酯提取后内源性杂质较多，对测定有干扰。本文首次采用乙醚作为提取溶剂，结果未发生乳化现象，且选择性强、操作简便、毒性较小、提取回收率高且稳定，是桂利嗪体内药物分析较好的方法。

[1]孙定人，张石革，梁三江.国家临床新药集[M].北京：中国医药科技出版社，2001：230～231.

[2]施洁明，何仲贵，刘晓红，等.2-羟丙基-β-环糊精对桂利嗪的增溶作用[J].中国新药杂志，2004，13（3）：233.

[3]李 扬，王 威，刘 蕾，等.盐酸氟桂利嗪片人体生物等效性研究[J].中国药房，2000，11（3）：120.

[4]刘玉旺，孙培红，赵 侠，等.氟桂利嗪胶囊的人体生物等效性研究[J].中国临床药理学杂志，2001，17（4）：277.

[5]汤丽芬，吴珏珩，李莉春，等.用反相高效液相色谱法测定人体血浆中盐酸氟桂利嗪含量[J].分析测试学报，2000，19（6）：75.